免疫组化

免疫组化1.石蜡切片常规脱蜡至水：二甲苯1、二甲苯2、100%乙醇，各10分钟，90%、80%、70%、50%乙醇、水，各5分钟。2.3%双氧水孵育5分钟，（27ml甲醇+3mlH2O2）；3.PBS3次5分钟/次；4.10%马血清封闭，37℃1小时；5.一抗，室温1小时，PBS3次5分钟/次；6.二抗，（1%BSA）室温30分钟，PBS3次5分钟/次；7.三抗，（1%BSA）室温30分钟，PBS3次5分钟/次；8.AEC染色，（现用现配）；9.甲基绿对染；10.水性封片剂封片。AEC染色液：4mgAEC溶于1ml二甲基甲酰胺中，加入14ml0.1M醋酸缓冲液（pH5.2），然后加入0.15ml3%H2O2，过滤除去沉淀物。3%H2O2：15ulH2O2+135ulH2O0.1M醋酸缓冲液（pH5.2）：0.2MNaAc79ml0.2MHAC21ml0.2MHAC：冰醋酸11.7ml，加水至1000ml；10×PBS(1000ml)NaCl80g,KCl2g,KH2PO42gNa2HPO47H2O11.5g(12H2O15.36g;无水6.047g),博士德客服10:53:44饱和苦味酸200ml，甲醛1瓶，冰醋酸1瓶，无水乙醇1箱，二甲苯10瓶，石蜡3盒，甘油1瓶，丙酮1瓶，APES10ml，载玻片6盒，盖玻片3盒，单面刀片10包，（眼科）剪刀、镊子10套，滤纸4盒，蜡笔1支，记号笔（小）1支，标签纸，染缸70个（二甲苯1、二甲苯2，100%、90%、80%、70%、50%乙醇/每套），湿盒4个（大），1000ml烧杯、量筒、细口瓶（每桌1套），100ml量筒1个，50ml量筒、移液管（5ml、1ml）、洗耳球1套，1000ul、20ul枪各1支，200ul枪3支，枪头若干，酒精灯，展片台2个，切片盒若干，显微镜，尖头镊子（钟表镊子），1ml注射器，250ml烧杯，胶头滴管，毛笔，1、一抗选择要点（1）选择单克隆还是多克隆抗体。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体，单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对较低；而多克隆抗体特异性稍弱，抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等有所避免）。（2）种属来源。一般家兔来源的抗体多是多克隆；而小鼠来源的抗体多是单克隆，但也有另外。这条主要要与后面的二抗来源相匹配。（3）实验目的是检测什么种属的抗原，即speciesreactivity。这一点很重要，一般说明书上都有注明，如小鼠Ms、大鼠Rat、人Hum等等。（4）能否做免疫组化。一般一抗说明书都会注明做WB、IHC、ICC、IF等，建议最好选择注明的抗体，因为一般都是经过文章证明。（5）检测标本类型。用于检测石蜡切片还是冰冻切片，一般能做石蜡切片的抗体，可能都可以用来检测冰冻切片，但能做冰冻切片的抗体，不一定能检测石蜡切片中的抗原。（6）生产厂家。我的经验是国外著名抗体生产商原装抗体质量一般没问题，但有点贵；而国内分装厂家用的一抗工作液，价格便宜，但有时结果的稳定性和重复性稍差，尤其不同批次重复性较差。（7）价格与质量的矛盾。我个人认为一抗原装质量可能会好点，因为许多一抗避免反复冻融，且在稀释液中稳定性较差（若时间长），但价格较贵。2、二抗选择要点（1）种属来源。主要根据一抗种属来源来决定购买二抗来源，如一抗是小鼠来源，那二抗就买抗小鼠的即可（羊、兔等均可）。（2）标记物的选择。有HRP、Biotin、荧光素等标记物。一般SP三步法二抗选择Biotin标记的二抗，以与后面的SP结合反应；而免疫荧光染色就需要购买不同荧光素标记的二抗，如罗丹明、FITC、Cy3等常用荧光素。这主要与后面有无三抗和三抗种类有关。（3）选择IgM还是IgG。一般一抗是IgM，那么二抗就选择IgM；反之，一抗是IgG，则二抗选择IgG。（4）生产厂家。一般SP三步法我们实验室选择中杉金桥的二抗染色试剂盒，内含有工作液的二抗，故试验中只需摸索一抗的浓度即可，效果还可以；而免疫荧光的二抗我一般选择JacksonImmnoResearch公司，效果还不错。