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1第八章分子发光分析法基本要求：了解荧光的产生和影响荧光强度的因素，掌握分子荧光光谱法的定量关系和应用特点，重点：荧光光谱法的定量关系、应用特点。难点：荧光的产生和影响荧光强度的因素。参考学时：3学时作业参考答案1.简述荧光法产生的基本原理。具有什么样结构的物质最容易发荧光？答：物质受电磁辐射激发后，被激发的分子从第一电子激发单重态的最低振动能级回到基态而发射荧光，基于测量化合物的荧光而建立起来的分析方法即为荧光分析法。芳香族化合物、带有平面刚性结构的化合物、带稠环结构的化合物容易发荧光。2.解释下列名词：单重态、三重态、荧光、振动弛豫、内转换、外转换、失活、系间窜跃、荧光量子产率、激发光谱、荧光光谱答：单重态：电子自旋都配对的分子的电子状态称为单重态。三重态：有两个电子自旋不配对而同方向的状态。荧光：受光激发的分子从第一激发单重态(S1)的最低振动能级回到基态(S0)所发出的辐射；振动弛豫：由于分子间的碰撞，振动激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级失活至较低振动能级，多余的振动能以热的形式失去的过程。内转换：在相同激发多重态的两个电子能级间，电子由高能级以无辐射跃迁方式进到较低能级的分子内过程。外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质间的相互作用和能量转换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程。失活：激发态分子不稳定，他要以辐射跃迁或无辐射跃迁的方式回到基态，这就是激发态分子的失活。系间窜跃：激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的无辐射跃迁过程。荧光量子产率：表示物质分子发射荧光的能力。荧光量子产率＝发射荧光的分子数/激发态的分子数＝发射的光子数/吸收的光子数激发光谱：在荧光最强的波长处测量随激发光波长的改变而变化的荧光强度，将荧光强度对激发光波长作图，即得到激发光谱，实际为荧光物质的吸收光谱。荧光光谱：如果将激发光的波长固定在最大激发波长处，测量不同荧光波长处荧光的强度，将荧光强度对荧光波长作图便得到荧光光谱（或称发射光谱）。3.溶液中，溶剂的极性、pH值及温度是如何影响荧光强度的。答：溶剂的影响：随着溶剂极性增加，荧光物质的n—π*跃迁能量增大，π—π*跃迁的能量降低，从而导致荧光强度增加，荧光波长红移。溶剂若能和荧光物质形成氢键或使荧光物质的电离状态改变，会使荧光强度、荧光波长改变。含重原子的溶剂（碘乙烷、四2溴化碳）能使荧光减弱。溶剂纯度对荧光强度的影响也很大。当溶剂中含卤素或重金属原子时，荧光强度降低。pH值的影响：pH值对荧光强度的影响是可逆的，含酸、碱性取代基的芳香化合物的荧光一般都与pH值有关，一些荧光物质在酸性或碱性溶液中会发生水解。而不会离解的荧光物质在任何pH值均产生荧光。温度的影响：温度降低会增加荧光强度，因为降低了碰撞与非辐射失活的概率。4.荧光物质浓度高时，为什么会发生荧光强度偏离F=2.3K’I0εbc光系式的情况？答：由Lambert-Beer定律可知，F=K’I0（1－e－2.303εbc），将此式中的指数项展开，当εbc0.05、I0一定时，荧光强度F＝Kc，所以低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质浓度呈线性关系。当c变得足够大使得吸光度.超过0.05时，F将偏向浓度轴。原因很多。首先是数学上的近似带来的误差，其次是入射光被强烈地吸收，造成溶液内部的入射光强锐减。当溶液浓度增加时，发光物质分子间碰撞还会产生自猝灭。当荧光化合物的发射波长与吸收峰重叠时，液体内部激发态分子所发射的荧光在通过外部溶液时被同类分子吸收，因而浓度增加同时会导致自吸收增强。5.试述为什么π-π*型跃迁的荧光要比π*-n型荧光易发生而且强度大。答：π-π*型跃迁产生的荧光要比π*-n型荧光强度大而且易发生，是由于π-π*跃迁属于电子自旋允许的跃迁，具有较大的ε，它一般比属于禁阻跃迁的n-π*跃迁ε大100-1000倍，其次π-π*跃迁的寿命约10-7-10-9s，比n-π*跃迁的寿命10-5－10-7要短，因而在与各种失活过程竞争中，π-π*跃迁更有利，此外，在π-π*跃迁过程中，因S1与T1能级差较大，通过系间窜跃至三重态的速率常数也较小，这也有利于荧光发射。6.荧光激发光谱与发射光谱之间有什么关系？答：激发光谱与发射光谱大致呈“镜像对称”。发射光谱的形状与基态中振动能级的分布状况有关，而激发光谱的形状则反映了第一电子激发单重态中振动能级的分布。基态和第一电子激发单重态中的振动能级分布情况类似，所以激发光谱与发射光谱大致呈镜像对称。7.用什么方法可以提高荧光分析法的灵敏度答：增大光源辐射强度I0（增加激发和发射光栅的宽度），放大荧光信号（增加光电倍增管PMT的电压）。8．试比较紫外-可见分光光度计与荧光光度计的异同点。不同点：第一是光源不同。荧光光度计光源为高压汞蒸气灯和高压氙弧灯，紫外-可见分光光度计用的光源是钨灯、碘钨灯、氢灯等；第二是吸收池不同。在荧光分光光度计中的荧光池是四面透明；透过荧光池的激发光方向与被测物发射的荧光是相互垂直的；而在紫外-可见分光光度计中，比色皿是两面透明；入射光与检测器是在同一直线上。相同点：都是由光源、单色器、吸收池、检测器四大主要部分组成。9．与过渡金属离子相比，非过渡金属离子的荧光螯合物要多，这是为什么？答：金属离子与有机配位体所形成的配合物的发光能力，与金属离子以及有机配位体结构特性有很大关系。金属离子可分为三类：第一类是离子的外电层具有与惰性气体相同的结构，为抗磁性的离子，它与含有芳基的有机配位体形成配合物时多数会发生较强的荧光，因为这类离子与有机配位体配合时，会使原来有机配位体的单线最低电子激发态3S1为n，π1*能层转变为π，π1*能层，并使原来的非刚性平面结构转变为刚性的平面结构，使原来不发荧光（或弱荧光）的有机配位体转变为发强荧光者。此类配合物的荧光强度随金属离子的原子量增加而减弱，吸收蜂和发射峰也相应向长波长方向移动，这一类配合物系由配位体L吸光和发光，故称L—L*发光。第二类金属离子亦具有惰性气体的外层电子结构和具有抗磁性，然而其次外电子层为含有未充满电子的f层。这类金属离子会产生f—f*吸光跃迁，亦会产生f*—f发光跃迁，但都较微弱，可是当它们和有机配位体生成二元配合物之后，由于f*能层多在配位体最低单线态的S1的π，π1*能层下方，因此被激发的有机配位体的能量可能转移给金属离子m而产生金属离子激发态m*（即m—m*跃迁），然后由激发态金属离子m*返回基态离子m而产生m*—m发光。第三类金属离子为过渡金属离子，它们与有机配位体所生成的配合物，大多数不发生荧光和磷光，其原因尚不清楚，目前有两种说法：一是认为它们是顺磁性物质，可能产生可逆的电荷转移作用而导致荧光猝灭，二是认为顺磁性和过渡金属的重原子效应引起电子自旋-轨函耦合作用，使激发态分子由单线态转入三线态，而后通过内转换去活化，在少数情况下，亦发现过渡金属离子会发光。10．试述化学发光分析的基本原理。它与荧光法有什么异同点？答：在某些化学反应中，某种反应产物或共存物分子由于吸收了反应产生的化学能，由基态跃迁至较高电子激发态中各个不同的振动能级，然后经过振动弛豫或内转换到达第一电子激发态的最低振动能级，由此以辐射的形式放出能量跃回到基态。在个别的情况下，它可以通过系间穿跃到达亚稳的三重态，然后再回到基态的各个振动能级，并产生磷光辐射，这两种光都是化学发光。物质的化学发光光谱与该物质的荧光光谱（个别的情况下与磷光光谱）是十分相似的，只是荧光和磷光是以光来激发，而化学发光则是靠化学能来激发的。11．化学发光反应需要满足的条件是什么？A．化学反应要提供足够的能量，而这一化学能又能被反应分子所吸收，形成一种激发态的产物。至少要有一种物质能够接受化学反应能量，形成激发态。化学发光反应的△G通常在40~70kcal/mol。B．在反应条件下，激发态分子或原子，能够以电磁辐射的形式释放出光子，回到基态；或者它能够转移能量到另一个分子上而使此分子被激发；这一分子回到基态时，释放出光子。满足上述条件的通常是氧化还原反应！12．什么是化学发光效率？化学发光效率愈大，化学发光的强度愈大，这个说法是否正确？化学发光效率ΦCL表示一个化学发光反应中的发光能力，它也等于产生激发态的化学效率Φr（激发态的分子数/反应分子数）与激发态分子的发射效率（发射光子数/激发态的分子数）的乘积。化学发光效率越大，化学发光的强度就越大，这个说法是错误的。发光强度与发光试剂的发光效率、发光时间以及发光试剂的浓度有关。不能单纯说化学发光效率越大，化学发光的强度就越大。13.化学发光分析有些什么特点与短处？化学发光分析法具有以下特点：①极高的灵敏度（2×10-11mol/L）；②化学发光具有较好的选择性（不同的化学反应很难产生出同一种发光物质）；③仪器装置比较简单，不需要复杂的分光和光强度测量装置（干涉滤光片，光电倍增管）；4④分析速度快，一次分析在1min之内就可完成，适宜进行自动连续测定。⑤定量线性范围宽，化学发光反应的发光强度和反应物的浓度在几个数量级的范围内成良好的线性关系。⑥化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当（△E=170~300kJ/mol），位于可见光区；⑦发光持续时间较长，反应持续进行。化学发光的短处：①化学发光反应发出的光通常都很微弱。②化学反应一般速度较快，发光信号会瞬间消失。所以样品与试剂能否快速、充分、均匀混合成为影响分析结果精密度的主要因素。