胶体金生产工艺配方原则

1胶体金诊断试剂工艺配方原则Madeby：QSHLJ2内容一、和膜相关的配方和原理二、和金子垫相关的配方和原理三、和样品垫相关的配方和原理四、相关问题Madeby：QSHLJ3一、和膜相关的配方和原理电镜下的NC膜Madeby：QSHLJ4硝酸纤维膜生产工艺图Madeby：QSHLJ5孔径定义的问题Madeby：QSHLJ6孔径对侧向层析速度的影响标称孔径(m)层析4.5cm的时间(sec)32455185814012100Madeby：QSHLJ7不同种类膜的IgG结合能力Madeby：QSHLJ8不同种类膜的BSA结合能力Madeby：QSHLJ9为什么蛋白会结合到膜上?结合力是什么?静电疏水力这两种结合力的效应是什么?使蛋白从溶液中分离出来长久结合作用Madeby：QSHLJ10静电作用力静电作用力是正负电荷相互吸引产生的作用力疏水作用力疏水作用力又称为疏水键。它是由侧链的疏水基团相互接近.而形成的一种作用力。对维持分子的三、四级结构起着重要的作用。每一个蛋白质都具有疏水基团和亲水基团。Madeby：QSHLJ11蛋白质疏水性状和亲水性状当蛋白质溶解在溶剂中时，蛋白质处于非常稳定的状态，此时蛋白质的亲水基团展开在外，疏水基团收缩在内，亲水基团和水分子接触，保证了溶解性的状态；当蛋白质沉淀出来时，疏水基团展开，亲水基团收缩，此时为疏水状态，也呈现不稳定的固体状态，疏水基团和其他固体物的疏水基团通过疏水作用力结合，达到固定的目的。Madeby：QSHLJ12蛋白结合到固相材料上蛋白结合到固相材料上是一个多步骤过程取决于蛋白溶液扩散到固相表面蛋白从溶液中分离出来蛋白吸附到固相上蛋白重排到最低能态Madeby：QSHLJ13吸附过程溶液中的蛋白蛋白转移到表面区域吸附蛋白在表面重排Madeby：QSHLJ14多位点结合只有1个位点的结合是可逆的多位点结合使得蛋白稳定在固相表面，即使其中的每个单位点都是可逆的Madeby：QSHLJ15影响蛋白结合的因素蛋白缓冲液使用的膜蛋白自身应用体系Madeby：QSHLJ16蛋白缓冲液没有通用的缓冲液，不同的系统必须分别优化。作用：提供适合的PH,改善亲水性,增溶性,提高稳定性定律:“蛋白在缓冲液中越不稳定，蛋白结合力越强”Madeby：QSHLJ17缓冲液的优化离子强度对于蛋白从溶液中脱离出来很重要，少量的离子强度，蛋白难以从溶液中脱离沉淀出来，过量的的离子强度，溶液配制中就已会出现沉淀。pH蛋白在等电点最不稳定沉淀剂通常用醇降低蛋白的稳定性，也可润湿膜，减少膜带有的静电，利于结合包被。盐通常不会影响对某些蛋白，两性离子的盐类有助于蛋白结合减少信号强度，消假阳Madeby：QSHLJ18糖：对包被蛋白的稳定性有重要作用，减缓老化速度，也可以增加亲水力。惰性蛋白：对消除假阳有重要作用表面活性剂：增加亲水力，也可增色。Madeby：QSHLJ19缓冲液的基本成分各种缓冲系:Tris-HCl,PB,CB等盐类：NaCl糖：蔗糖，海藻糖等表面活性剂：Tween20，Tritonx-100等惰性蛋白：Casein等防腐剂：叠氮钠，卡松等Madeby：QSHLJ20推荐的起始缓冲液10mMPhosphatepH7.03%EthanolMadeby：QSHLJ21“潜水艇”效应表面活性剂处理过的膜在使用时的常见问题因为使用的表面活性剂是水溶性的喷膜时这些表面活性剂被“冲走”了Madeby：QSHLJ22反应动力学流速增加,反应速率减低流速增加,检测时间缩短流速增加,灵敏度降低流速增加,试剂用量增加流速增加,背景降低距离增加,流速降低孔径增加,蛋白结合量减少Madeby：QSHLJ23二、和金子垫相关的配方和原理和金子垫相关的工艺和配方有：1）标记工艺；2）金标稀释液3）金垫处理液Madeby：QSHLJ24标记工艺胶体金：一般指金的水溶液，又称金溶胶。---金以微小的粒子分散在水中所形成的金溶胶。其中分散的金颗粒直径一般在1~100nm之间，为负电荷分布。Madeby：QSHLJ25高质量结合物单个分散的颗粒圆形颗粒很少聚集这样得到的胶体稳定性和重复性好Clusterfree,highqualitygoldreagentClustered,poorqualitygoldreagentMadeby：QSHLJ26胶体金的生产胶体金的形成是还原HAuCl4.HAuCL4+e-Au0还原剂越强，得到的金颗粒越小生产40nm诊断用金颗粒一般用柠檬酸三钠Madeby：QSHLJ27胶体金颗粒的形成Madeby：QSHLJ28胶体金的生产2种重要步骤直接形成分步形成大多数人用分步形成比较容易控制颗粒大小，CV也比较小能够生产出大颗粒胶体金Madeby：QSHLJ29颗粒大小对胶体的影响Madeby：QSHLJ30蛋白标记原理蛋白质在等电点或稍偏碱的情况下，依靠静电引力或疏水力或共价键，被牢固地吸附于胶体金颗粒表。由于蛋白质分子牢固地结合在金颗粒表面，形成一个蛋白层，从而阻止了胶体金颗粒的相互接触，使该胶联溶液较为稳定。Madeby：QSHLJ31要点蛋白的预处理使用低浓度和正确的pH值，确保最小的聚集合适的蛋白量（可通过盐滴定进行评价）搅拌速度、容器的洁净程度、离心的速度Madeby：QSHLJ32盐滴定盐滴定不能衡量蛋白单层的形成盐滴定只能代表盐溶液中多少量的蛋白可以使胶体金稳定pH和时间都会有影响Madeby：QSHLJ33蛋白邦定作用力电荷作用力（静电作用力）疏水力共价键Madeby：QSHLJ34Madeby：QSHLJ35金标稀释液合适的离子种类和强度，0.2M左右，常用有磷酸盐等。大分子物质作为胶体金干燥后均匀散布的骨架，常用大分子物质如PEG4000，PEG20000，PVP。小分子物质对蛋白活性保护，蛋白储存常用的甘油、蔗糖、海藻糖、各类低聚糖等，对产品的储存稳定性有帮助。Madeby：QSHLJ36惰性蛋白，它是保护目的蛋白的活性，也维持胶体金的胶体稳定，它们是消除非特异性的封闭物质，也起着有分散胶体金颗粒的骨架作用。常用有BSA、OVA、Casein。表面活性剂，具有增加亲水性，促进结合等作用。常用的有Tween-20，Tritonx-100。Madeby：QSHLJ37评价金标稀释液的参数金子释放程度及速度。金标液稳定性。灵敏度、特异性Madeby：QSHLJ38结合物释放垫的原理什么是结合物释放垫?孔径开放快速层析低蛋白结合力理想的亲水性传统材料是包被PVA的玻纤Madeby：QSHLJ39典型结合物释放垫材料的构意图玻纤高分子PVA外壳Madeby：QSHLJ40侧向层析中结合物释放垫的原理做什么用(理论上)？让结合物完好无损的干燥加样后让结合物快速释放实际应用中侧向层析中结合物释放垫可能遇到的问题比其它任何组分都多Madeby：QSHLJ41标准结合物释放垫的性能45秒内释放出约70%的结合物但是垫上保留的结合物降低了灵敏度，因为:较少的结合物到达捕获线较少的抗原到达捕获线在侧向层析系统中灵敏度要好线条CV值一般在15-20%Madeby：QSHLJ42储存于20oC时结合物释放率Madeby：QSHLJ43金垫处理液作用：增加亲水性,促进复溶,保持稳定性基本成分：1）缓冲系统：磷酸，碳酸，硼酸，Tris,生物缓冲液等。2）表面活性剂：Tween-20，Tritonx-100等。3）大分子物质：PEG4000，PEG20000，PVP，PVA4）惰性蛋白：BSA、OVA、Casein。5）小分子保护物质：糖类物质，如蔗糖，海藻糖等。Madeby：QSHLJ44结合物释放常见问题释放不充分释放慢释放垫再次湿润困难Madeby：QSHLJ45释放不充分结合物绑定到释放垫上了用聚合物和表面活性剂封闭释放垫在储存过程中，结合物发生聚集控制封闭剂的用量控制溶液的离子强度Madeby：QSHLJ46释放慢您的释放垫是怎样封闭的?是否加了亲水试剂？是否用了大量的蛋白?是否用了大量的糖?试纸条各组分之间接触紧密么?Madeby：QSHLJ47释放垫再次湿润困难您使用的是哪一种释放垫?是亲水的么?您是怎样封闭释放垫的?Madeby：QSHLJ48三、和样品垫相关的配方和原理作用：改变样本PH,调节爬速,控制金标释放，抑制非特异性吸附,降低背景基本成分：1）缓冲系统：磷酸，碳酸，硼酸，Tris,生物缓冲液等。2）表面活性剂：Tween-20，Tritonx-100等。3）大分子聚合物质：PEG4000，PEG20000，PVP，PVA4）惰性蛋白：BSA、OVA、Casein。5）生物物质：鼠IGg，抗红细胞抗体等。Madeby：QSHLJ49血清类样品垫注意爬速，背景，灵敏度的达到和假阳的消除。全血类样品垫1）必须能够去除红细胞！2）还需具备下列功能不能造成溶血不能干扰样品分离必须快速高效必须能够分离一定范围内的不同血样量灵敏度的达到和假阳的消除Madeby：QSHLJ50尿液类样品垫注意交叉反应的消除。Madeby：QSHLJ51影响抗原抗体反应的外部因素电解质抗原与抗体发生结合后，由亲水胶体变为疏水胶体的过程中须有电解质参与才能进一步使抗原抗体复合物表面失去电荷，水化层破坏，复合物相互靠拢聚集，形成大块的凝集或沉淀。若无电解质参加，则不出现可见反应。为了促使沉淀物或凝集物的形成，常用O.85％氯化钠或各种缓冲液作抗原及抗体的稀释液及反应液。但电解质的浓度不宜过高，否则会出现盐析现象。Madeby：QSHLJ52酸碱度蛋白质具有两性电离性质，因此每种蛋白质都有固定的等电点。抗原抗体反应必须在合适的pH环境中进行，pH过高或过低都将影响抗原与抗体的理化性质。抗原抗体反应一般在pH为6～9进行。Madeby：QSHLJ53温度抗原抗体反应必须在合适的温度中进行，一般以15～40℃为宜，最适反应温度为37℃。某些特殊的抗原抗体反应，对温度有一些特殊的要求，例如冷凝集素在4℃左右与红细胞结合最好，20℃以上反而解离。Madeby：QSHLJ54反应时间反应时间越长，抗原抗体反应越充分，显色也越深。所有调整辅料的思路都可从抗原抗体反应的影响因素和辅料的成分性质进行考虑和设计。Madeby：QSHLJ55四、相关问题假阳问题假阴问题稳定性问题上样问题Madeby：QSHLJ56（一）假阳问题未标记上的金颗粒（裸金）电荷作用疏水作用硫醇类物质的存在（S-H键起作用）抗原抗体作用（内源性物质）抗凝剂和防腐剂的影响其他原因Madeby：QSHLJ57未标记上的金颗粒（裸金）裸金聚集，周围具有大量的负电荷，当样本爬过金垫，裸金随着向上跑，在T线位置只要碰到带有正电荷的蛋白，即发生反应，形成假阳线条。解决方法：检查标记过程，BSA封闭Madeby：QSHLJ58电荷作用胶体金颗粒带有负电荷，当遇上带有正电荷的蛋白，易发生非特异性结合反应，导致假阳。反应环境为酸性时，已发生此类结合。解决方法：改变pH和盐度Madeby：QSHLJ59疏水作用抗原抗体结合以及和胶体金结合都需要用到疏水作用力，当反应环境中存在疏水物质时，易和胶体金或抗原抗体通过疏水作用力结合，产生假阳结果，如标本里的一些脂肪，细胞碎片，细菌等等。解决方法：用表面活性剂或亲水聚合物进行处理。Madeby：QSHLJ60抗原抗体作用此类作用是指标本里面含有能和标记材料/包被材料发生免疫反应的非目标物的其他物质导致的假阳结果。常见的有毒品的交叉反应，如KET试剂检测美沙酮标本，呈现阳性反应，就是美沙酮和KET材料发生了交叉反应；又有SG试剂中的抗鼠抗体反应等等。解决方法：在样品垫或金子垫或硝酸纤维素膜上加入相应的抗体，将这类物质在T线前消除掉。Madeby：QSH