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葡萄糖钳夹技术的建立与应用1钳夹技术高葡萄糖钳夹技术高胰岛素正葡萄糖钳夹技术DeFronzoRA,TobinJP,AndresR.AmJPhysiol,1979,237:E214-S2232相关背景知识糖尿病是高度异质性疾病，目前认为主要是由于胰岛素抵抗合并胰岛B-细胞分泌胰岛素缺陷或B-细胞分泌缺陷伴或不伴胰岛素抵抗引起。3如何评价胰岛素抵抗？1.高胰岛素正葡萄糖钳夹技术。（可重复性好，最精确。）2.微小模型法（MMT）。3.各种简易指数。4如何评价B-细胞功能?葡萄糖刺激的胰岛素分泌：高葡萄糖钳夹、最小模型法、IVGTT、OGTT非糖物质刺激：胰高糖素试验、精氨酸试验、甲苯磺丁脲B-细胞产生的非胰岛素肽类：C-肽、胰淀素。5高葡萄糖钳夹技术的建立与应用6原理及应用1通过输注外源性葡萄糖使血糖浓度较空腹状态迅速升高,并在一定时间内维持相对平稳的高糖状态。在这种持续的高糖状态下，可以观察到胰岛素在糖刺激后的快速分泌相（第一相），以及随后出现的与高糖持续时间一致的第二相分泌，并能测定稳态下机体最大的分泌胰岛素的能力，从而能完整的评估胰岛B细胞的储备和分泌胰岛素的功能。7原理及应用2同时由于大部分的内源性葡萄糖生成被抑制，外源性葡萄糖的输注率即被认为是组织葡萄糖的利用率，通过计算可以得到胰岛素敏感性指数，其与评价胰岛素敏感性的“金标准”-----高胰岛素正葡萄糖钳夹的相关性较好。8实验仪器：1、输液泵一台。2、快速血糖测定仪一台。3、温度控制仪一台。4、多功能计时秒表两个。9实验物品1、输液管（输液泵专用）。2、三通管3个。3、连接管2条。4、静脉留置针2个。5、针筒：1ml，5ml，60ml针筒各若干个。10受试者准备试验前晚8点钟后禁食，可少量饮水，早晨8点到实验室，排空小便后仰卧。试验前，将试验的性质、目的以及可能产生的不良反应告知受试对象，并填写知情同意书。受试者应排除肝肾疾病。试验前三天，受试对象每日至少进食250克以上碳水化学物，维持体重稳定。11主要试剂1、葡萄糖液：50%。2、葡萄糖液：10%。3、氯化钠溶液：0.9%。12高葡萄糖钳夹操作流程11.配备20%葡萄糖液：可在10%葡萄糖液中加入50%葡萄糖混合配制。2.令受试者排空小便后仰卧于床，整个实验过程中保持清醒安静状态。3.分别在两侧上肢静脉留置穿刺针，以生理盐水维持通道，以备抽血及输注20%葡萄糖。13高葡萄糖钳夹操作流程24.分别于-30，-15，0分钟留取基础血样后，一侧上肢置于一温度为50°C，湿度为70%的恒温箱中以获得动脉化的静脉血样，另一侧静脉通道用于输注20%葡萄糖。14高葡萄糖钳夹操作流程35.20%葡萄糖的输注分两个阶段：第一阶段为初始剂量阶段，使血糖在14分钟内升高7.9mmol/L，其具体的输注率按DeFronzo提供的体表面积经验值及实际操作中每2分钟测得的血糖值调节。第二阶段为维持剂量阶段，葡萄糖输注率以实验15-150分钟内每5分钟测得的血糖值根据负反馈原则调节，并记录调节时间。15高葡萄糖钳夹操作流程46.标本采集；于开始输注葡萄糖0-10分钟内每2分钟取血测定胰岛素，以后每10分钟取血一次，测定胰岛素。每30分钟取血一次测定胰高糖素。实验结束后收集实验过程中的尿液，测定尿糖含量。7.留取部分实验中输注的葡萄糖液测定精确的葡萄糖浓度。16结果处理1一）评价B细胞功能：1.计算第一时相胰岛素分泌（first-phaseinsulinrelease,1PH）：1PH=∑Ins(2,4,6,8,10mins).2.计算第二时相胰岛素分泌（second-phaseinsulinrelease,2PH）；2PH=∑Ins（20-150mins）/143.最大胰岛素分泌量（maximuminsulinsecretion,INS120-150）:INS120-150=∑Ins（120-150mins）/417结果处理2二）评价胰岛素敏感性：1.葡萄糖输注率（INF，mg/kg/min）:根据输液泵调节情况及个体体重校正实际葡萄糖浓度后计算。2.空间校正值（SC，mg/kg/min）：是对实际血糖变化时葡萄糖空间充溢或不足的情况加以校正。18结果处理3二）评价胰岛素敏感性4.尿糖（UC，mg/kg/min）：实验过程中尿糖的排出量。5.葡萄糖代谢率（M，mg/kg/min）：M=INF-SC-UC6.胰岛素敏感性指数（SI）：SI=M120-150/I120-150*10019高胰岛素正葡萄糖钳夹技术的建立与应用20一原理及应用1通过持续输注外源性胰岛素和葡萄糖，抑制内源性肝糖产生和胰岛素分泌，达到外源性胰岛素-葡萄糖代谢平衡状态后，评价个体内胰岛素对葡萄糖代谢的作用程度，也就是胰岛素的敏感性。21二实验仪器1.输液泵一台。2.注射泵一台。3.快速血糖测定仪一台。4.温度控制仪一台。5.多功能计时秒表两个。22三实验物品1.输液管（输液泵专用）。2.三通管4个。3.连接管2条。4.静脉留置针2个。5.针筒：1ml，5ml，60ml针筒各若干个。6.胰岛素针管（BD笔）。23四主要试剂：1.葡萄糖液：50%。2.葡萄糖液：10%。3.氯化钠溶液：0.9%。4.人正规胰岛素。24五受试者准备：1.试验前三天，受试对象每日至少进食250克以上碳水化学物，维持体重稳定。2.试验前晚8点钟后禁食，可少量饮水，早晨8点到实验室，排空小便后仰卧。3.试验前，将试验的性质、目的以及可能产生的不良反应告知受试对象，并填写知情同意书。25六高胰岛素正葡萄糖钳夹技术高葡萄糖钳夹操作流程1.配备20%葡萄糖液：可在10%葡萄糖液中加入50%葡萄糖混合配制2.配制胰岛素输注液：根据研究对象的体重计算胰岛素需要量，在100ml0.9%生理盐水中先加入2ml受试者的血，以防止胰岛素粘附于瓶壁，然后加入胰岛素混合。3.受试者空腹12小时，早晨8点到实验室，排空小便后仰卧于床，于整个实验过程中保持清醒安静状态。26六高胰岛素正葡萄糖钳夹技术高葡萄糖钳夹操作流程4.分别在两侧上肢静脉留置穿刺针，以生理盐水维持通道，以备抽血及输注胰岛素及20%葡萄糖。5.分别于-30，-15，0分钟留取基础血样后，一侧上肢置于一温度为50°C，湿度为70%的恒温箱中以获得动脉化的静脉血样，另一侧静脉通道用于输注胰岛素及20%葡萄糖。27六高胰岛素正葡萄糖钳夹技术高葡萄糖钳夹操作流程6.胰岛素的输注分两个阶段：在钳夹开始10分钟内快速输注胰岛素液使血浆胰岛素水平迅速升高，随后140分钟内用注射泵以40mU/m2/min速度持续输注。在此期间每5分钟测一次动脉化的血浆葡萄糖浓度，调整20%葡萄糖输注率，使受试者血糖值维持在正常水平，通常设置在80-90mg/dl。7.标本采集；于开始输注葡萄糖0-10分钟内每2分钟取血测定胰岛素，以后每10-20分钟取血一次，测定胰岛素。每30分钟取血一次测定C肽、胰高糖素、皮质醇及生长激素。28六高胰岛素正葡萄糖钳夹技术高葡萄糖钳夹操作流程8.留取部分实验中输注的葡萄糖液及胰岛素溶液测定精确的葡萄糖和胰岛素浓度。29七结果处理1.葡萄糖输注率（INF，mg/kg/min）:根据输液泵调节情况及个体体重校正实际葡萄糖浓度后计算。INF=set(ml/min)*time(min)*200/BW*10.2.空间校正值（SC，mg/kg/min）：是对实际血糖变化时葡萄糖空间充溢或不足的情况加以校正。SC=3.795*SA*(G1-G2)/BW.3.葡萄糖代谢率（M，mg/kg/min）：M=INF-SC，为方便读数可乘以100。30钳夹技术的优缺点评价优点:准确。缺点：复杂、昂贵、费时。31高糖钳夹在科研和临床中的应用1.通过了解胰岛素的早期和晚期分泌相，了解早期潜在的B细胞功能损害，并能直接比较不同个体在相同的葡萄糖浓度介导下的胰岛素分泌反应。2.可应用逐步高糖钳夹来获得最大的胰岛素分泌量，了解B细胞在不同浓度葡萄糖刺激下的分泌胰岛素的能力。32高糖钳夹在科研和临床中的应用3.可在行高糖钳夹的同时输注其它物质，如脂肪、氨基酸等，观察这些物质对B细胞分泌胰岛素能力的影响。4.对存在B细胞功能损害的人进行药物或其他干预后，重复高糖钳夹评价干预的效果。33高糖钳夹在科研和临床中的应用5.根据葡萄糖输注率及血浆胰岛素浓度可知晓机体葡萄糖利用率，即胰岛素敏感性。6.高糖钳夹可作为标准，对其它有关评价B细胞功能的简易参数的精确性进行评估。34正糖钳夹在科研和临床中的应用价值1.评价机体在生理及各种病理状态下胰岛素的敏感性。2.了解个体胰岛素抵抗的程度，结合其他方法研究胰岛素抵抗的部位和机制。3.了解糖、脂、蛋白质等物质代谢对胰岛素敏感性的影响。35正糖钳夹在科研和临床中的应用价值4.了解药物及其它非药物因素对胰岛素敏感性的影响。5.对其它评价胰岛素敏感性的简易参数的准确性进行评估。36