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1检验技术资格考试考点精要——微生物学检验（中级）1.生物学按界门纲目科属种分类，种是最小单位。病毒分类：目、科、亚科、属、种。属名--VRirus结尾的单词,亚科名--VRirinae结尾的单词,科名--VRiridae结尾的单词。目名—VRirales。2004年ICTV公布病毒分为：73个科、11个亚种、289个属。2.结核菌可利用甘油为碳源，梭状芽胞菌可以氨基酸为碳源，流感嗜血杆菌要Ⅴ，Ⅹ因子才能生长。3.药物敏感试验：纸碟法、小杯法、凹孔法、试管法。常用单片纸碟法、试管稀释法（以抗菌药物的最高稀释度仍能抑制细菌生长或杀菌管为终点，该管含药浓度为最低抑菌浓度MIC或最低杀菌浓度MBC），两值越低则表示越敏感。MIC与抑菌圈呈负相关，即抑菌环直径越大，MIC越小。各药敏纸片间距不少于24mm，距平板内缘不小于15mm。药物敏感实验判定标准：抑菌圈直径（毫米）：20以上极敏、15~20高敏、10~14中敏、10以下低敏。不同的菌株、不同的抗生素纸片需参照NCCLs的标准或者CLSI标准。多黏菌素抑菌圈；在9毫米以上为高敏，6—9毫米为低敏，无抑菌圈为不敏。4.常用的免疫技术：酶免疫技术（EIA）、协同凝集试验、免疫荧光技术（IF）、对流免疫电泳（CIE）、免疫印迹技术。5.病原菌核酸的检测：核酸杂交、PCR技术、基因芯片技术。PCR技术—是选择DNA或RNA体外扩增技术，用标本提取DNA为扩增模板，选用一对特异寡核苷酸为引物，PCR一般要经历三十多次循环，经不同温度变性93-94℃（作用1min氢键断裂形成单链DNA）、退火40-60℃（迅速冷却30-60s引物与DNA模板结合，形成局部双链）、延伸70-75℃（在TaqDNA聚合酶作用下，以A、T、G、C四种脱氧核苷酸为原料，从引物5’→3’端延伸，合成与模板互补的DNA链。），扩增产物用溴乙啶染色的凝胶电泳。其具有特异、快速、灵敏、特异性强、操作简便、能够定量。引物是PCR特异性的决定因素，PCR反应中TaqDNA聚合酶、引物加量过多，可引起非靶序列扩增。变性DNA常发生一些理化及生物学性质的改变：1）溶液粘度降低。2）溶液旋光性发生改变。3）增色效应。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性,此过程称之为退火，Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件。核酸实验中经常以迅速冷却至4℃以下方式保持DNA的变性(单链)状态。基因芯片技术（DNA芯片、DNA微阵列）—主要过程：DNA微阵列的制备、样品的制备、靶分子和探针之间的杂交、杂交信号的检测与分析。具有快速、敏感、高通量检测平台。核酸杂交（基因探针杂交技术）--是指单链RNA和DNA或DNA和DNA或RNA和RNA，根据碱基配对原则，借氢键相连而形成杂交分子的过程。杂交百分率＞70%（≥69%）为高度同源性，同源性在60%以上是一个种，同源性在60%--70%是同一种内不同亚种，同源性在20%--60%同一属内不同菌种，同源性220%≤不同属的菌种。AFLP的含义是----扩增片段长度多态性。有很大功能的DNA指纹技术。一种是罕见切割酶，一种是常用切割酶。具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。6.细菌诊断流程有：双岐索引法，表解法，数字编码鉴定法。致病性岛：由基因编码决定的一团与致病性相关的基因组。7.病原细菌确定原则：（郭霍Koch原则）1、从一种疾病病人中能有规律地发现一种细菌2、能够分离这种细菌获得纯培养3、把这种细菌的培养物引入易感动物体内，可以引起与病人类似的疾病4、在实验感染引起的疾病中仍然能够分离同一种细菌。8.杆菌肽用于A（敏感）与非A群链球菌的鉴定。O/129抑菌试验对弧菌有用而对气单胞菌无用。9.奥普托欣试验：肺炎链球菌敏感。10.杂交分：斑点，菌落原位，Southern（DNA）印迹，Northern（RNA，DNA）印迹。11.L型细菌：细胞壁缺陷（形态多样，染色不定，可过滤，渗透压敏感，生化减弱等）培养应高渗透压（3-5%氯化钠、20%蔗糖），琼脂浓度0.5以下半固体培养基。染色多为G染阴性，形态不一（巨球形是特征），固定要用10g/L鞣酸不能用火焰。增殖：以二分裂、出芽、巨形体释放颗粒方式。一般菌落有：油煎蛋样（L），颗粒型（G），丝状菌落（F），鉴定要点：染色易变多形性，生长在增菌液中微浑，颗粒样沉淀或沿试管壁生长，返祖现象。致病特点：慢性和反复发作性感染，致病物质是毒素。L型细菌在体内体外都可形成。原生质体与原生质球都是细胞壁缺陷的细菌。12.细菌的突变：基因突变（又称点突变；有碱基对的置换、插入、或缺失、错码）、染色体畸变（易位、倒位、重复、缺失）。突变：自发突变、诱发突变。质粒在细菌的自发突变中起重要作用。细菌质粒在重组DNA技术中常用的载体。质粒的分离提纯使用酚处理，用乙醇沉淀。13.噬菌体--是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒，具有病毒的基本特性，专性胞内寄生，有严格的宿主特异性。由核酸和蛋白质组成。大多数DNA噬菌体的DNA为线状双链（有尾噬菌体的核酸）；RNA噬菌体的RNA为线状单链（无尾噬菌体的核酸为环状单链DNA或线状单链RNA）。对紫外线敏感10-15分钟失去活性。噬菌体分毒性噬菌体、温和噬菌体（溶原性噬菌体）；毒性噬菌体以复制方式增殖，过程吸附、穿入、生物合成、成熟与释放，少脱壳。在液体培养基中使混浊菌液变澄清，在固体培养基上形成噬斑。温和噬菌体---是噬菌体基因组整合于宿主菌染色体中，有溶原性周期、溶菌性周期。噬菌体可以根据不同细菌的表面受体来裂解目标菌---是判定某些种类病原体的重要依据。14.肽聚糖的结构由聚糖骨架，四肽侧链和五肽交联桥（G－无交联桥）。磷壁酸为G＋特有，分壁和膜两种。外膜层由脂多糖，脂质双层，脂蛋白组成。细胞质内有核蛋白体（蛋白合成地），核质（主3要遗传物质）质粒，胞质颗粒，是细菌蛋白质和酶类合成的重要场所。鞭毛是由细胞质伸出的蛋白性丝状物。性菌毛仅有1～10根，毒力和耐药质粒都能通过它转移，有致病性。15.免疫器官：骨髓、胸腺、脾、淋巴结、扁桃体、小肠集合淋巴结、阑尾和黏膜免疫系统。免疫细胞：淋巴细胞、单核吞噬细胞、中性粒细胞、嗜酸嗜碱性粒细胞、肥大细胞、血小板。免疫分子：补体、免疫球蛋白、细胞因子中枢免疫器官：骨髓、胸腺、鸟类法氏囊。外周免疫器官：淋巴结、脾和粘膜相关淋巴组织特异性免疫：体液免疫、细胞免疫。体液免疫：（B淋巴细胞介导，CD4+Th辅助，Th2细胞能分泌细胞因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-10）；效应是抗体（Ab）；1、病毒中和抗体（不能直接灭活病毒，IgG、IgM、IgA）2、血凝抑制抗体（HLAb）3、补体结合抗体。IgG在体液中含量最多，分子量小是唯一能通过胎盘的抗体。IgM分子量大，是最早产生的抗体，中作早期诊断。IgA存在黏膜分泌液中，在局部可阻止病毒侵入，能抵抗蛋白酶的水解作用，具局部抗体。IgE可与肥大细胞膜上的Fc受体结合。补体C：存在血清中，不耐热，可辅助特异性抗体介导的溶菌作用，是抗体发挥溶细胞作用的必要补充条件。由9种成份，11种蛋白组成。补体激活两个途径：传统途径（一）---被Ag-Ab免疫复合物IC活化，顺序C1、C4、2C、3C、5C、6C、7C、8C、C9。旁路途径（二）---被细胞的脂多糖激活。补体激活---酶促级连反应。细胞免疫（T淋巴细胞介导，效应细胞：细胞毒性T细胞（CTL）、CD4+Th1细胞、CD8+毒性T细胞CTL）。Th1细胞诱导产生迟发型超敏反应（DTH）16.测特异性抗原最常用实验：凝集试验、酶联免疫吸附试验、免疫荧光试验、胶体金免疫吸附试验17.细菌营养转运的方式有：离子，透性酶，磷酸酶。营养物质进入机体的方式：易化扩散、主动运转（由透性酶完成）、基团移位（糖类由磷酸酶磷酸化进入胞内，不能再透出菌体）。18.细菌生长繁殖的条件:充足的营养、适宜的温度、合适的酸碱度、必须的气体环境。细菌生长的温度极限-7--90℃：嗜冷菌最适温为10～20℃，嗜温菌为20～40℃，嗜热菌为50～60℃。适宜的酸碱度PH7.2—7.6。细菌生长繁殖分为四期：迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期19.（肠道杆菌）细菌的四种生化反应：吲哚（I）、甲基红（M）、VP（V）、枸橼酸盐利用（C），合称为IMViC。大肠杆菌呈++--，产气杆菌呈--++。还需做糖发酵试验，KIA产酸产气，MIU＋――，有菌体（O）荚膜（K）鞭毛（H）三抗原。肠杆菌科分型多采用苯丙氨酸脱氨酶和葡萄糖酸盐试验。可疑菌分别接种克氏双糖铁（KIA）尿素靛基质动力（MIU）来定属。细菌代谢所需能量主要以生物氧化作用而来。细菌新陈代谢的产物：热原质、毒素与酶、色素、抗4生素、细菌素。热原质除去的最好方法---蒸馏。内毒素（G-脂质A）、外毒素（G+产生的毒性蛋白质产物，具有抗原性强、毒性强、作用特异性强、不耐热、人工化学可脱毒性，0.4%甲醛脱毒后形成类毒素进行人工免疫）。据亲和性及作用靶点分为:神经毒素、细胞毒素、肠毒素。细菌的内毒素一般由：脂质A（主要成份），非特异性核心多糖，菌体特异性多糖。一般7～10天后机体产生特异性免疫。IgG和IgM能在血中直接中和病毒。热原质：脂多糖，多由G-产生，耐高温，可引起发热反应，高压蒸气灭菌（121℃20分钟）使其破坏。20.细胞壁的作用：承受胞内高渗压、支持细胞膜、维持细菌形态；是鞭毛运动的支点。细胞壁的主要成份：肽聚糖（又称黏肽、胞壁质），是原核生物特有的成份，能破坏肽聚分子结构或抑制其合成的物质，都有抑菌和杀菌作用。G-菌细胞壁的主要成份：肽聚糖、脂蛋白、外膜、脂多糖（LPS）（类脂A、核心多糖、特异性多糖），菌体脂多糖（LPS）能引起发热故称热原质，又称为细菌的内毒素。细胞膜的主要功能：物质纳泄、生物合成、呼吸作用、形成中介体。细胞质中的异染颗粒主要成份：RNA、多偏磷酸盐21.有芽胞破伤风菌需沸水煮3h才杀死。水中加入2%碳酸钠能将沸点提到105℃又能防止金属生锈。22.紫外线波长265～266nm时杀菌力最强。日光灯波长约0.5µm。23.滤菌器用于除菌的孔径是0.22µm，另外以石棉板为滤板的金属滤器称Seitz滤器（蔡氏滤器）按滤孔大小分K：最大，澄清用，EK-S最小，可阻止大病毒通过EK：居中，除去一般细菌。玻璃滤菌器分G1～G6，G5，G6两型能阻止细菌通过。24.高压灭菌指示物：嗜热脂肪芽胞杆菌（ATCC7053），紫外线杀菌指示物：枯草芽胞杆菌黑色变种（ATCC9372）。25.细菌遗传物质主要在于染色体、质粒和转位因子中。质粒：不依赖染色体而复制，不相容性，转移性，指令性，大多数质粒在自然状态下是一种闭合环状双链DNA。主要有耐药质粒，Col质粒（编码肠毒素）Vi质粒（编码细菌与致病性有关的蛋白）。转位因子为存在于细菌染色体或质粒上的一特异的核苷酸序列可在DNA中移动，主要有三类：插入顺序（最小的转位因子），转座子，转座噬菌体。质粒载体具有特点：复制起点、抗菌素抗性基因、多种限制酶的单一切点、较高的拷贝数26.病毒的特性：1、只含一种核酸2、基因组复制3、缺乏完整的酶系统4、RNA病毒的RNA经反转录合成互补DNA（CDNA）。甘油（10％）或10%二甲基亚砜的血清作悬浮细胞的液体在液氮中保存细胞，在干冰温度（-70℃）和液态氮温度（-196℃）下长期保存其感染性；将冻存在小管或安瓿里的细胞以较慢的冷冻速率（1℃／分钟）冷冻，直至—150℃，再将这些小管贮存在—150～－196℃的液氮中，解冻做法是：将封口的小管迅速放入37℃的水中，直至所有的冰融化，然后打开管口，将内容物移入培养5基。PH5-9稳定；射线和紫外线、X线、r线能灭活病毒。病毒学上常用的细胞类型：原代细胞、二倍体细胞、传代细胞。27.超净工作台应采用层流技术净化空气、选择垂直气流通风方式。洁净度可达百级，只保护样品。28.菌体蛋白电离后带负电荷；而碱性染料电离时染料离子带正电。29.染色程序及方法：制片→固定→媒染→染色→脱色→复染→水洗→干燥→镜检。革兰染色法：初染（草