法规-转基因植物安全评价指南

法规转基因植物安全评价指南转基因植物安全评价指南转基因植物安全评价指南二〇一〇年九月二十五日二〇一〇年九月二十五日目　　录目　　录前　　言前　　言3一、总体要求一、总体要求4（一）分子特征（一）分子特征41．表达载体相关资料．表达载体相关资料42．目的基因在植物基因组中的整合情况．目的基因在植物基因组中的整合情况53．外源插入片段的表达情况．外源插入片段的表达情况5（二）遗传稳定性（二）遗传稳定性61．目的基因整合的稳定性．目的基因整合的稳定性62．目的基因表达的稳定性．目的基因表达的稳定性73．目标性状表现的稳定性．目标性状表现的稳定性7（三）环境安全（三）环境安全71．生存竞争能力．生存竞争能力72．基因漂移的环境影响．基因漂移的环境影响73．功能效率评价．功能效率评价84．有害生物抗性转基因植物对非靶标生物的影响．有害生物抗性转基因植物对非靶标生物的影响85．对植物生态系统群落结构和有害生物地位演化的影响．对植物生态系统群落结构和有害生物地位演化的影响96．靶标生物的抗性风险．靶标生物的抗性风险9（四）食用安全（四）食用安全91．新表达物质毒理学评价．新表达物质毒理学评价92．致敏性评价．致敏性评价113．关键成分分析．关键成分分析114．全食品安全性评价．全食品安全性评价125．营养学评价．营养学评价126．生产加工对安全性影响的评价．生产加工对安全性影响的评价137．按个案分析的原则需要进行的其它安全性评价．按个案分析的原则需要进行的其它安全性评价13二、阶段要求二、阶段要求13（一）申请实验研究（一）申请实验研究13（二）申请中间试验（二）申请中间试验14（三）申请环境释放（三）申请环境释放15（四）申请生产性试验（四）申请生产性试验16（五）申请安全证书（五）申请安全证书1700001前　　言前　　言根据《农业转基因生物安全管理条例》和《农业转基因生物安全评价管理办法》，在总结我国农业转基因生物安全评价多年实践经验以及借鉴国外转基因生物安全评价方法的基础上，农业部组织专家研究制定了《转基因植物安全评价指南》，并经过了多次修改完善。本指南用于指导和规范转基因植物安全评价的申报和评审工作。本指南是一个技术性指导文件，是在现有法规框架内细化了转基因植物安全评价的资料要求。本指南由总体要求和阶段要求两部分组成。总体要求从转基因植物分子特征、遗传稳定性、环境安全和食用安全等四个方面分别描述评价指标和资料要求。阶段要求是在总体要求的基础上，进一步明确转基因植物实验研究、中间试验、环境释放、生产性试验和申请安全证书各阶段安全评价的基本要求。由于转基因生物本身特性和生物技术飞速发展，很难以一个评价指南涵盖转基因植物安全评价的所有情况。本指南是转基因植物安全评价的一般性资料要求。针对某一具体转基因植物的安全评价，应当采取个案分析的原则，具体问题具体分析。转转基因植物安全基因植物安全评评价指南价指南一、总体要求一、总体要求（一）分子特征（一）分子特征　　从基因水平、转录水平和翻译水平，考察外源插入片段的整合和表达情况。1．表达载体相关资料．表达载体相关资料（（1）目的基因与载体构建的物理图谱）目的基因与载体构建的物理图谱　　详细注明表达载体所有元件名称、位置和酶切位点。（（2）目的基因）目的基因详细描述目的基因的供体生物、结构（包括基因中的酶切位点）、功能和安全性。供体生物：如Bt基因cry1A来源于苏云金芽孢杆菌XX菌株。结构：完整的DNA序列和推导的氨基酸序列。功能：生物学性状，如抗鳞翅目昆虫。安全性：从供体生物特性、安全使用历史、基因结构、功能及有关安全性试验数据等方面综合评价目的基因的安全性。（（3）表达载体其他主要元件）表达载体其他主要元件启动子：供体生物来源、大小、DNA序列（或文献）、功能、安全应用记录。终止子：供体生物来源、大小、DNA序列（或文献）、功能、安全应用记录。标记基因：供体生物来源、大小、DNA序列（或文献）、功能、安全应用记录。报告基因：供体生物来源、大小、DNA序列（或文献）、功能、安全应用记录。其他表达调控序列：来源（如人工合成或供体生物名称）、名称、大小、DNA序列（或文献）、功能、安全应用记录。2．目的基因在植物基因组中的整合情况．目的基因在植物基因组中的整合情况采用转化事件特异性PCR、Southern杂交等方法，分析外源插入片段在植物基因组中的整合情况，包括目的基因和标记基因的拷贝数，标记基因、报告基因或其它调控序列删除情况，整合位点等。外源插入片段的转化事件特异性PCR检测：具有片段名称、引物序列、扩增产物长度、PCR条件、扩增产物电泳图谱（含图题、分子量标准、阴性对照、阳性对照、泳道标注）。外源插入片段的Southern杂交：采用两种以上限制性内切酶分别消化植物基因组总DNA，获得能明确整合拷贝数的、具有转化事件特异性的分子杂交图谱。文字描述至少包括探针序列位置、内切酶名称、特异性条带的大小、图题、分子量标准、阴性对照、阳性对照、泳道标注。外源插入片段的全长DNA序列：实际插入受体植物基因组的全长DNA序列和插入位点的两端边界序列（大于300bp）。提供转化事件特异性PCR验证时相应引物名称、序列及其扩增产物长度。3．外源插入片段的表达情况．外源插入片段的表达情况（（1）转录水平表达（）转录水平表达（RNA））采用Real-timePCR,RT－PCR或Northern杂交等方法，分析主要插入序列（如目的基因、标记基因等）的转录表达情况，包括表达的主要组织和器官（如根、茎、叶、种子等）。RT－PCR检测：引物序列、扩增产物长度、RT-PCR条件、扩增产物电泳图谱（含图题、分子量标准、阴性对照、阳性对照、泳道标注）。Northern杂交：探针序列位置、特异性条带的大小、Northern杂交条件、杂交图谱（含图题、分子量标准、阴性对照、阳性对照、泳道标注）。（（2）翻译水平表达（蛋白质））翻译水平表达（蛋白质）采用ELISA或Western杂交等方法，分析主要插入序列（如目的基因、标记基因等）的蛋白质表达情况，包括表达的主要组织和器官（如根、茎、叶、种子等）。ELISA检测：描述定量检测的具体方法，包括相关抗体、阴性对照、阳性对照、光密度测定结果、标准曲线等。Western免疫印记：相关抗体名称、特异性蛋白条带的大小、Western免疫印记条件、免疫印记图谱（含图题、分子量标准、阴性对照、阳性对照、泳道标注、样品和阳性对照的加样量）。（二）遗传稳定性（二）遗传稳定性主要考察转基因植物世代之间目的基因整合与表达情况。1．目的基因整合的稳定性．目的基因整合的稳定性用Southern或转化事件特异性PCR手段检测目的基因在转化体中的整合情况，明确转化体中目的基因的拷贝数以及在后代中的分离情况，提供不少于3代的试验数据。2．目的基因表达的稳定性．目的基因表达的稳定性用Northern，Real-timePCR，RT-PCR,Western等手段提供目的基因在转化体不同世代在转录（RNA）和（或）翻译（蛋白质）水平表达的稳定性（包括不同发育阶段和不同器官部位的表达情况），提供不少于3代的试验数据。3．目标性状表现的稳定性．目标性状表现的稳定性用适宜的观察手段考察目标性状在转化体不同世代的表现情况，提供不少于3代的试验数据。（三）环境安全（三）环境安全1．生存竞争能力．生存竞争能力提供在自然环境下，转基因植物与受体关于种子活力、种子休眠特性、越冬越夏能力、抗病虫能力、生长势、生育期、产量、落粒性等适合度变化与杂草化风险评估等的试验数据和结论。若受体植物为多年生草类（饲草、制种用的草坪草）或目标性状增强生存竞争力（如抗旱、耐盐等），应根据个案分析的原则提出有针对性的补充资料。2．基因漂移的环境影响．基因漂移的环境影响（（1）受体物种的相关资料）受体物种的相关资料如果存在可交配的野生近缘种，提供野生近缘种的地理分布范围、发生频率、生物学特性（生育期、生长习性、开花期、繁殖习性、种子及无性繁殖器官的传播途径等）以及与野生近缘种的亲缘关系（包括基因组类型、与栽培种的天然异交结实性（%）、杂种F1的育性及其后代的生存能力和结实能力）的资料。如果存在同一物种的可交配植物类型，需提供同一物种植物类型的分布及其危害情况。（（2）外源基因漂移风险）外源基因漂移风险对于存在可交配的野生近缘种或存在同一物种可交配的植物类型，又无相关数据和资料的，可设计试验评估外源基因漂移风险及可能造成的生态后果，如基因漂移频率、外源基因在野生近缘种中表达情况、目的基因是否改变野生近缘种的生态适合度等。3．功能效率评价．功能效率评价提供自然条件下转基因植物的功能效率评价报告。如为有害生物抗性转基因植物，则需要提供对靶标生物的抗性效率试验数据。抗性效率指抗有害生物转基因植物所产生的抗性物质对靶标生物综合作用的结果，一般通过转基因品种与受体品种在靶标生物数量变化、危害程度、植物长势及产量等方面的差别进行评价。抗病虫转基因植物需提供在室内和田间试验条件下，转基因植物对靶标生物的抗性生测报告、靶标生物在转基因品种及受体品种田季节性发生危害情况和种群动态的试验数据与结论。4．有害生物抗性转基因植物对非靶标生物的影响．有害生物抗性转基因植物对非靶标生物的影响根据转基因植物与外源基因表达蛋白特点和作用机制，有选择地提供对相关非靶标植食性生物、有益生物（如天敌昆虫、资源昆虫和传粉昆虫等）、受保护的物种等其它非靶标生物潜在影响的评估报告。5．对植物生态系统群落结构和有害生物地位演化的影响．对植物生态系统群落结构和有害生物地位演化的影响根据转基因植物与外源基因表达蛋白的特异性和作用机理，有选择地提供对相关动物群落、植物群落和微生物群落结构和多样性的影响，以及转基因植物生态系统下病虫害等有害生物地位演化的风险评估报告等。6．靶标生物的抗性风险．靶标生物的抗性风险靶标生物的抗性是指靶标生物由于连续多代取食转基因植物，敏感个体被淘汰，抗性较强的个体存活、繁殖、逐渐发展成高抗性种群的现象。抗病虫害转基因植物需提供对靶标生物的作用机制和特点等资料，转基因植物商业化种植前靶标生物的敏感性基线数据，抗性风险评估依据和结论，拟采取的抗性监测方案和治理措施等。（四）食用安全（四）食用安全按照个案分析的原则，评价转基因植物与非转基因植物的相对安全性。传统非转基因对照物选择：无性繁殖的转基因植物，以非转基因植物亲本为对照物；有性繁殖的转基因植物，以遗传背景与转基因植物有可比性的非转基因植物为对照物。对照物与转基因植物的种植环境（时间和地点）应具有可比性。1．新表达物质毒理学评价．新表达物质毒理学评价（（1）新表达蛋白资料）新表达蛋白资料提供新表达蛋白质（包括目标基因和标记基因所表达的蛋白质）的分子和生化特征等信息，包括分子量、氨基酸序列、翻译后的修饰、功能叙述等资料。表达的产物若为酶，应提供酶活性、酶活性影响因素（如pH、温度、离子强度）、底物特异性、反应产物等。提供新表达蛋白质与已知毒蛋白质和抗营养因子（如蛋白酶抑制剂、植物凝集素等）氨基酸序列相似性比较的资料。提供新表达蛋白质热稳定性试验资料，体外模拟胃液蛋白消化稳定性试验资料，必要时提供加工过程（热、加工方式）对其影响的资料。若用体外表达的蛋白质作为安全性评价的试验材料，需提供体外表达蛋白质与植物中新表达蛋白质等同性分析（如分子量、蛋白测序、免疫原性、蛋白活性等）的资料。（（2）新表达蛋白毒理学试验）新表达蛋白毒理学试验当新表达蛋白质无安全食用历史，安全性资料不足时，必须提供急性经口毒性资料，28天喂养试验毒理学资料视该蛋白质在植物中的表达水平和人群可能摄入水平而定，必要时应进行免疫毒性检测评价。如果不提供新表达蛋白质的经口急性毒性和28天喂养试验资料，则应说明理由。（（3）新表达非蛋白质物质的评价）新表达非蛋白质物质的评价新表达的物质为非蛋白质，如脂肪、碳水化合物、核酸、维生素及其它成分等，其毒理学评价可能包括毒物代谢动力学、遗传毒性、亚慢性毒性、慢性毒性/致癌性、生殖发育毒性等方面。具体需进行哪些毒理学试验