第六章-免疫标记技术

免疫标记技术经典免疫学技术•沉淀反应•凝集反应•补体参与的抗原抗体反应•中和反应沉淀反应凝集反应补体参与的抗原抗体反应中和反应经典免疫学技术的不足•灵敏度•周期长•可重复性•无法定量•无法定位•特异性差关键问题免疫标记技术（immunolabellingtechnique）用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。免疫标记技术分类：免疫酶技术(ng)、放射免疫技术(pg)、免疫荧光技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术、发光免疫测定。特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位第八章免疫标记技术第一节放射免疫技术第二节免疫荧光技术第三节酶免疫技术第四节其他免疫标记技术第八章免疫标记技术第一节放射免疫技术第二节免疫荧光技术第三节酶免疫技术第四节其他免疫标记技术一、放射免疫技术二、免疫放射技术第一节放射免疫技术一、放射免疫技术二、免疫放射技术第一节放射免疫技术（一）放射免疫技术的原理（二）放射免疫技术的基本条件（三）放射免疫技术的基本类型一、放射免疫技术（一）放射免疫技术的原理（二）放射免疫技术的基本条件（三）放射免疫技术的基本类型一、放射免疫技术放射免疫技术（radioimmunoassay，RIA）（1977年获诺贝尔生理和医学奖）放射免疫技术的原理RIA是以放射性同位素标记抗原的一种竞争性免疫抑制试验（一）放射免疫技术的原理（二）放射免疫技术的基本条件（三）放射免疫技术的基本类型一、放射免疫技术（二）放射免疫技术的基本条件1．抗原标准品与待测抗原2．放射性同位素3．特异性抗体4．常用的同位素标记方法5．B与F的分离技术1．抗原标准品与待测抗原标准品是放免技术的定量依据标准品：与待测样品的化学结构完全相同替代品：与待测样品的结构相似，但要与抗体的亲和力相近，应列出与真标准品的换算系数。2.放射性同位素表8-1生物医学中常用的放射性同位素核素名称衰变方式半衰期化学状态主要用途51CrEC27.8dNa251CrO4标记59Fe，-45d59FeCl3标记58CoEC,+71d58CoCl3标记125IEC60dNa125I标记与诊断131I-8.1dNa131I标记、诊断与治疗99mTc-，IT6.1dNa99mTcO4标记与脏器显像3H-12.3a3H水，3H气标记与示踪14C5730aBa14CO3标记与示踪32P-14.3dNaH232PO4标记与治疗35S-86.7dNa235SO4标记3.特异性抗体放射免疫技术的抗体应具备：特异性高、亲和力高（平衡常数K值大）、效价高（即抗血清高度稀释时仍能迅速与抗原结合，极少解离，保证检测的灵敏度）4.常用的同位素标记方法氯胺T氧化标记法乳过氧化物酶标记法半抗原标记法5.B与F的分离技术（1）双抗体沉淀分离法（2）化学试剂分段沉淀分离法（3）固相法（4）吸附法结合态标记抗原B与游离态标记抗原F能否有效地分离是放射免疫技术的一个重要环节。分离剂的要求能使B和F完全分离不受外界因素的干扰与游离抗原的非特异性作用尽可能小操作简便、分离迅速、重复性好来源广，经济，便于使用（1）双抗体沉淀分离法优点：本法操作简便、稳定缺点：易受免疫反应液中其他蛋白质或盐的干扰，使非特异性吸附有较大变异，且第二抗体消耗量大。加入第二抗体使微量抗原抗体复合物的分子加大，从而使原来不能用普通离心法沉淀的抗原抗体复合物易于沉淀而分离。（2）化学试剂分段沉淀分离法利用盐类或有机化合物使反应液中的-球蛋白在等电点沉淀，从而达到分离的目的。如：聚乙二醇（PEG）、硫酸铵等优点：试剂来源广泛、价格便宜缺点：影响因素多（温度、pH值、浓度等）（3）固相法将测定用的第一抗体（或第二抗体）牢固地结合于固相载体表面，相应抗原（或第一抗体）经温育被吸附，只要将固相表面洗涤即将B和F分离。优点：操作简便、快速新的固相分离方法：纤维固相抗体竞争法可磁化颗粒固相抗体竞争法试管固相法（4）吸附法本法多用于小分子半抗原的放射免疫分析。如：活性炭、硅镁吸附剂、滑石粉等性质：对蛋白质、多肽、药物等具有非特异性吸附的能力应用：在其表面包被一层白蛋白或右旋糖苷等物质时，将会限制大分子物质的吸附。沉淀中：吸附有游离的抗原或半抗原上清液中：抗原抗体复合物优点：操作简便、分离迅速缺点：专一性不强（一）放射免疫技术的原理（二）放射免疫技术的基本条件（三）放射免疫技术的基本类型一、放射免疫技术（三）放射免疫技术的基本类型1．液相法（1）平衡法（又称一步法）（2）顺序加样法2．固相法（1）竞争法Ag+Ag*+Ab-（2）改良法Ag+Ag*+Ab+AntiAb-一、放射免疫技术二、免疫放射技术第一节放射免疫技术（一）免疫放射技术的原理（二）免疫放射技术的基本条件（三）免疫放射技术的基本类型二、免疫放射技术（一）免疫放射技术的原理（二）免疫放射技术的基本条件（三）免疫放射技术的基本类型二、免疫放射技术1986年Miles和Hales建立免疫放射分析技术（immunoradiometricassay，IRMA）标记抗体作示踪剂，在反应系统中加入过量的抗体，待测物（或标准品）和同位素标记抗体全量反应。优点：灵敏度高（可提高6-10倍）、准确度高、重复性好、检样量少缺点：干扰因素较多、检测仪器贵、有放射性污染免疫放射技术（immunoradiometricassay，IRMA）表8-2IRMA与RIA的主要区别IRMARIA被标记物质抗体抗原抗体用量过量限量被检抗原分子量相对较大相对较小反应方式分步结合竞争结合B、F分离方法固相洗涤分离液相沉淀或吸附分离（一）免疫放射技术的原理（二）免疫放射技术的基本条件（三）免疫放射技术的基本类型二、免疫放射技术（二）免疫放射技术的基本条件1．标记抗体的制备2．固相抗原免疫吸附剂（一）免疫放射技术的原理（二）免疫放射技术的基本条件（三）免疫放射技术的基本类型二、免疫放射技术（三）放射免疫技术的基本类型1.经典IRMA法2.双抗体夹心法3.二抗标记法4.双标记抗体法1.经典IRMA法2.双抗体夹心法标记3.二抗标记法4.双标记抗体法双标记抗体是将两种针对不同表位的抗体（Ab2、Ab3）标记上不同的同位素，可以用不同的检测仪进行测定。放射分析技术方法学考核指标第八章免疫标记技术第一节放射免疫技术第二节免疫荧光技术第三节酶免疫技术第四节其他免疫标记技术一、免疫荧光技术的原理二、免疫荧光技术的基本条件三、经典荧光抗体染色法四、现代免疫荧光技术第二节免疫荧光技术一、免疫荧光技术的原理二、免疫荧光技术的基本条件三、经典荧光抗体染色法四、现代免疫荧光技术第二节免疫荧光技术AlbertHewettCoons（1912—1978）20世纪40年代Coons等首先用荧光素FITC标记抗体，成功地检测了小鼠肺脏组织内存在的肺炎双球菌多糖抗原，从而创建免疫荧光技术（immuno-fluorescencetechnique）。一、免疫荧光技术的原理三结合：抗原抗体反应的高度特异性荧光的敏感可测性显微技术的高度精确性优点：特异性强、敏感性高、速度快，结果直观，可以检测和定位微量抗原缺点：荧光易发生淬灭，荧光染色标本保存困难、易出现非特异性染色问题，镜检结果判定客观性不足一、免疫荧光技术的原理二、免疫荧光技术的基本条件三、经典荧光抗体染色法四、现代免疫荧光技术第二节免疫荧光技术1.荧光素2.荧光标记物的制备3.荧光检测仪二、免疫荧光技术的基本条件1.荧光素2.荧光标记物的制备3.荧光检测仪二、免疫荧光技术的基本条件1．荧光素荧光素：可以产生明亮荧光的染色物质荧光素的性质吸收光后电子跃迁保持固有的荧光特性荧光的波长总是大于激发光波长（STOKES法则）荧光强度小于激发光的强度荧光效率=发射光量子数/吸收光量子数×100%荧光强度=吸收光量子数×荧光效率荧光的种类自发荧光二次荧光非特异性荧光：自发荧光诱发荧光酶诱发荧光荧光素选择条件荧光强度高且稳定能轻易与蛋白质分子形成稳定共价键荧光素与蛋白质结合的方法应简便、快速产生的荧光颜色应与自发荧光对比鲜明结合物在一般贮存条件下性能稳定，可保存较长时间荧光素1.荧光素2.荧光标记物的制备3.荧光检测仪二、免疫荧光技术的基本条件荧光标记抗体的制备（1）搅拌标记法（Marshall法）（2）半透膜透析标记法（Clark法）荧光标记抗体的纯化（1）去除游离荧光素（2）去除未标记和过度标记的抗体荧光标记抗体的鉴定（1）抗体与荧光的活性鉴定（2）荧光素与蛋白质的摩尔比值（F/P）采用紫外分光比色法测定FITC（F）OD值和蛋白质（P）OD值以后，用以下公式计算F/P比值：F/P比值=（2.87×OD495）/（OD280—0.35×OD495）（3）荧光抗体浓度的测定（4）荧光抗体特异性的鉴定：特异性吸收试验，竞争抑制试验1.荧光素2.荧光标记物的制备3.荧光检测仪二、免疫荧光技术的基本条件3.荧光检测仪（1）荧光显微镜（2）荧光分光光度计（1）荧光显微镜透射式落射式透射荧光显微镜原理低倍镜较明亮，高倍镜较暗，在油浸和调中时，较难操作，尤以低倍的照明范围难于确定，但能得到很暗的视野背景。透射式不适用于非透明的被检物体。落射式荧光显微镜激发滤光板位于聚光镜和光源之间，可滤过由荧光灯源发射出的其他光，只允许波长为275～480nm的紫外光（MG）和蓝紫光（BG）通过，以激发荧光结合物发射荧光。汞灯光源:提供激发光(U、V、B、G)激发滤色镜:波长选择分色镜:反射激发光,透过荧光吸收滤色镜:透过荧光,阻挡杂光落射荧光显微镜原理对透明和不透明的被检物体都适用。由于物镜起了聚光镜的作用，不仅便于操作，而且从低倍到高倍，可以实现整个视场的均匀照明。（2）荧光分光光度计用于扫描荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数，从各个角度反映了分子的成键和结构情况。一、免疫荧光技术的原理二、免疫荧光技术的基本条件三、经典荧光抗体染色法四、现代免疫荧光技术第二节免疫荧光技术1.直接荧光抗体染色法2.间接荧光抗体染色法3.补体荧光染色法4.特殊染色法三、经典荧光抗体染色法1.直接荧光抗体染色法2.间接荧光抗体染色法3.补体荧光染色法4.特殊染色法三、经典荧光抗体染色法1.直接荧光抗体染色法优点：简单、快速、特异性高缺点：检测每种抗原需制备相应抗体、敏感性差将荧光素标记在特异性抗体上，直接检测抗原1.直接荧光抗体染色法2.间接荧光抗体染色法3.补体荧光染色法4.特殊染色法三、经典荧光抗体染色法2.间接荧光抗体染色法优点：敏感性高、一种二抗可检测多种抗原抗体系统缺点：干扰因素多、操作流程长将荧光素标记在第二抗体（抗抗体）上或标记在SPA上，检测与抗原结合的特异性抗体肿瘤组织中M2型巨噬细胞1.直接荧光抗体染色法2.间接荧光抗体染色法3.补体荧光染色法4.特殊染色法三、经典荧光抗体染色法3.补体荧光染色法优点：可检测所有抗原抗体系统，具有通用性；敏感性高缺点：操作过程较复杂，干扰因素多，易出现非特异性染色，补体易失活将荧光素标记在补体的抗体上（抗C3抗体），检测抗原抗体复合物。1.直接荧光抗体染色法2.间接荧光抗体染色法3.补体荧光染色法4.特殊染色法三、经典荧光抗体染色法4．特殊染色法（1）双标记免疫荧光技术（2）双色免疫荧光技术（3）反衬染色法（1）双标记免疫荧光技术在同一标本中，可用两种不同颜色的荧光标记抗体进行染色，同时显示两种不同的细胞或同一细胞上不同的抗原。如：FITC（黄绿色荧光）标记Ab1—RB200或TRITC9（桔红色荧光）标记Ab2细胞内双标记荧光染色DAPI+FITCFITC+PI（2）双色免疫荧光技术如FITC标记抗体和细胞核染色剂PI（红色）DAPI（蓝色）（3）反衬染色法是用一种非特异染色来反衬一种免疫荧光试剂的特异性染色。如：用RB200标记BSA作为非特异性反衬标记，用FITC标记特异性抗体