生物酶工程

AdvancedEnzymeEngineering第九章生物酶工程Contents一、生物酶工程的定义二、生物酶工程的内容三、生物酶工程的前景GoGoGo生物酶工程是酶学和以基因重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物，亦称高级酶工程(AdvancedEnzymeEngineering)。一、生物酶工程1.定义二、生物酶工程的内容（3）从蛋白质或基因水平上设计，合成酶杂合体或自然界不曾有的酶（杂合酶）。生物酶工程主要包括：（1）用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）；（2）修饰酶基因产生遗传修饰酶（突变酶）；（4）抗体酶；（5）核酶。通过基因工程手段，克隆各种天然酶的基因，将其克隆到表达载体中，然后将表达载体转化到适当的宿主中，得到表达特定酶的基因工程菌，通过基因工程菌的繁殖大量产生的酶称为克隆酶。1.克隆酶（1）克隆酶的定义：克隆酶图例基因工程菌载体宿主生物体发酵克隆酶酶基因外源基因转入微生物宿主细胞内，与宿主细胞的遗传物质相结合，后代宿主的遗传物质中含有外源基因，这种带上人工赋予的新的遗传特性的宿主微生物，被称为基因工程菌。2.基因工程菌的定义（1）在宿主细胞内可以自主复制；（2）克隆酶对载体的要求（2）容易引入受体细胞；（3）具有合适的筛选标记基因；（4）具有少数限制性酶切位点。（3）克隆酶对宿主的要求（1）安全可靠，非致病菌；（3）有利于酶的分离和纯化；（5）容易培养和管理。（4）能利用廉价的原料，发酵周期短，产量高；（2）外源基因在宿主内能够表达且不被分解；（4）克隆酶基因的表达系统原核生物的基因表达系统真核生物的基因表达系统1.酵母表达系统2.植物表达系统3.动物表达系统4.丝状真菌表达系统纤维素酶基因工程菌的构建（5）克隆酶实例纤维素酶纤维素酶在食品、饲料、造纸、纺织等行业具有广泛的用途。但由于天然纤维素酶产量低、来源有限而导致其大规模应用受到限制。纤维素酶（cellulase）是能将纤维素水解为葡萄糖等简单糖类的一组酶的总称。为此，通过基因工程技术，克隆福寿螺体内的纤维素酶基因，构建含有cel的基因工程菌，以期通过液体培养或固体培养的方式得到大量的克隆纤维素酶。afp基因转化受体低温筛选技术路线1A.bgpdL.egpdV.vgpd+表达载体PEG介导转化农杆菌介导转化电激转化分子鉴定原生质体或菌丝球建立转化体系低温筛选体系建立技术路线2Cel基因工程菌株的筛选液体发酵分离纯化定义：利用有控制地对天然酶基因进行剪切、修饰或突变，从而改变这些酶的催化特性、底物专一性或稳定性，使之更加符合人们的需要。2.突变酶遗传修饰改变酶的性能大致有：（1）提高酶的活性（2）提高酶的稳定性（3）改变底物专一性（4）改变酶的最适pH值（5）改变酶对辅酶的要求（6）改变酶的别构调节能力修饰酶基因的方法主要方法（i）定位突变（ii）体外定向进化定位突变（site-directedmutagenesis）是根据酶的结构、功能和作用机制的信息，在基因水平上精确改变酶分子中的氨基酸残基，对酶的性质和其催化特性进行改造，产生符合特定需要的酶。（i）定位突变盒式诱变寡聚苷酸引物诱变PCR诱变方法：（1）盒式诱变原理：利用一段人工合成的具有突变序列的寡聚核甘酸片段（寡核甘酸盒，OligonucleotideCassette），取代野生型基因中的相应序列。HindIIIEcoRIHindIIIEcoRI+（2）寡聚苷酸引物诱变原理：用化学合成的含有突变碱基的寡核甘酸短片段作为引物，启动单链DNA分子进行复制，生产出来的新链中目的基因的特定位点具有已经发生突变的碱基序列。A转化GTAGAATCGCTTCTACTAGGCTAP标记筛选分离突变体（3）PCR诱变定点诱变法大引物诱变法特点：可以在DNA区段的任何部位产生定点突变。原理：在头两轮的PCR反应中，应用两个互补的并在相同部位具有相同碱基突变的内侧引物，扩增形成两条有一端可彼此重叠的双链DNA片段，两者在其重叠区段具有同样的突变。故此两条双链DNA片段经变性和退火处理，形成两种不同形式的异源双链分子。然后选用两个外测寡核甘酸引物进行第三轮PCR扩增，可得到一种含有突变位点的突变体DNA。5’3’5’3’靶DNA片段5’5’3’3’混合、变性、退火定点诱变法5’3’5’3’大引物诱变法5’5’3’3’大引物PCRPCRPCR多次循环PCR一．理论来源利用基因工程原理可以在实验室中模拟生物进化过程化学进化生物进化（ii）体外定向进化人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外对基因进行随机突变，从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或者人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过一定的筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶的分子进化技术称为体外定向进化。体外定向进化定向进化示意图细菌诱发突变的因素500C培养突变体库选择压力（温度）温度耐受型突变体最适生长温度为370C最适生长温度提高了！随机突变+定向选择＝目标突变体Strategiesforthedevelopmentofeffectiveenzymes定向进化属于蛋白质的非合理设计，它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。定向进化＝随机突变＋选择澄清一个事实：定向进化不是定点突变定向进化：突变筛选突变位点是随机的，不确定的；突变位点的数目也是不确定的；突变的效应更是不可预知的；理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的，生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。定点突变：突变位点是确定的，突变的个数也是预知的；突变的效应可能是已知的，也可能是未知的；定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。易错PCR技术(error-pronePCR)DNA改组(DNAshuflling)：由美国Stemmer于1994年首次提出一项体外重组技术随机引发重组(RPR)1998年,Arnold提出了一种有效的新方法交错延伸技术(StEP)：由Zhao等提出,是一种简化的DNAshuffling技术随机突变的策略易错PCR易错PCR：是一种简单、快速、廉价的随机突变方法。原理：利用TaqDNA聚合酶不具备3’-5’校正功能的特点通过改变PCR的条件，通常降低一种dNTP的量（降至5%-10%）使PCR易于出错，达到随机突变的目的。还可以加入dITP来代替被减少的dNTP，又会使下一轮循环中出现更多的错误。在PCR缓冲液中另加入Mn2+，亦有利于提高突变率。DNA改组DNA改组(DNAshuffling)又称有性PCR(sexualPCR)，原理如图所示。PCR扩增体外定向进化成功实例Lipasegenes(lipB52,lipB68)isolatedfromPseudomonasfluorescensB52、B68GenbankAccssionnumberAY623009、AY694785成功实例ZhengbingJiang,Yitaozheng,YuLuo,GangWang,HongpingWang,YushuMaandDongzhiWei*.CloningandExpressionofaNovelLipaseGeneFromPseudomonasfluorescensB52.MolecularBiotechnology.2005(31),095-102.SDS-PAGEanalysisoflipaseonexpressionandpurificationfunctionallipasesecretedbyRecombinantsscreenedwithBMMYplates体外随机引发重组体外随机引发重组(randompriminginvitrorecombination,RPR)以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度。交错延伸(staggerextensionprocess,StEP)在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步,缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸。此过程反复进行，直到产生完整的基因长度。交错延伸定向进化是一个由构建突变体库，突变体表达，表达后筛选三个步骤组成的循环递进过程，需要：(1)产生包含大量带有微量有利突变的突变体的文库;(2)突变体应能在适当的微生物(如大肠杆菌或酵母菌)体内进行功能的表达;(3)必须有一种灵敏的筛选方法,能反映出由一个氨基酸的置换而引起的预期性状的较小提高。环境库和噬菌体展示库的构建环境库的构建：（1）采集环境样品；（2）提取DNA，连接到合适的载体上；（3）转入合适的宿主菌。噬菌体展示库的构建在噬菌体衣壳蛋白基因中插入外源基因，形成融合蛋白表达在噬菌体颗粒蛋白的表面，被展示的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物学活性。噬菌体展示的基本原理：利用靶分子，采用适当的淘洗方法（亲和→洗脱→扩增→亲和的循环步骤），洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体；外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过噬菌体DNA序列测序出来，使得表达蛋白（表现型）和编码基因（基因型）之间完美地结合起来。噬菌体展示库的构建步骤：可分为选择（selection）和筛选（screening）。选择：通过添加或减少某种成分使目的菌株获得生长优势，而其它菌株的生长受到抑制，通过多次的筛选分离最终得到目的菌株。检测：通常是在培养基中加入某种试剂或化学药物，使培养后发生某种可以辨别的变化，如培养基的透明度的变化或菌落周围颜色的变化，由此区别不同类型或生理特性不同的微生物。（容易实现高通量筛选）定向进化的筛选策略琼脂板涂布法在特殊条件下培养突变菌，通过宿主菌的生长情况、培养基颜色、特定反应的出现等判断是否具有目的基因。微孔板悬浮法在含生色底物平板上培养，挑取具有活性的克隆接种到96孔板上检测吸光度。使用微流控芯片。微球细胞固定法与数字成像系统结合，将单个细胞附着在单个固体珠上，突变体进行分离和筛选。流式细胞计数法细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，排成单行，逐个通过流式细胞计数仪进行测定。突变体分离通过酶促反应的特征加入底物显色荧光共振能量转移同位素标记底物通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测酶检测信号探测分光光度计和荧光酶标仪气相色谱和高效液相色谱质谱和核磁目标酶所需功能方法结果实施菌种卡那霉素核苷基转移酶热稳定性定位诱变+选择在60-50℃酶半衰期增加200倍耐热脂肪芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶作用于有机溶剂易错PCR+选择在60％二甲基亚砜主仆女冠活力增强170倍枯草杆菌β-内酰胺酶作用于新底物DNA改组+选择对cefotaxime的抗性增加32000倍大肠杆菌对硝基苯酯酶有机溶剂中的底物特异性和活性易错PCR+重组活力增加60-150倍大肠杆菌胸苷激酶第五特异性基因理疗交错延伸+选择活力增加43倍大肠杆菌β-半乳糖苷酶底物特异性DNA改组+选择活力增加66倍底物特异性增加1000倍大肠杆菌砷酸脱毒途径砷酸抗性DNA改组+选择抗性增加12倍大肠杆菌定向进化的应用3.杂合酶杂合酶是把来自不同酶分子中的结构单元或是整个酶分子进行组合和交换，以产生目的所需的优化酶杂合体。杂合酶的构建策略：（1）二级结构的互换；（2）功能域替换；（3）融合蛋白。杂合酶的制备方法：（1）同源扫描突变；（2）反-内蛋白子的应用；（3）DNA增长截短法；（4）同源基因的改组—SCRATCHY库。同源扫描突变：几个同源酶PCR扩增，然后用内切核酸酶切割，不同的切割产物混合组合，T