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动物实验基本知识和操作技术上海中医药大学实验动物中心汤家铭进行动物实验操作前必须注意的事一、动物福利和动物实验伦理问题什么是动物福利？•动物福利是指动物在整个生命过程中应得到人类的保护，其基本原则是要善待动物，保证动物的健康和快乐。•动物福利的提出是基于这样一个观点，即动物与人一样，有思维、有情感，应当给予与人一样的生存权。•台湾学者夏良宙（1990年）把动物福利概括成两句话：善待活着的动物，减少动物死亡的痛苦。应该再加一句：动物死后应得到妥善处理。在国际上被普遍认可的动物福利包括以下5个内容，即：1.应提供给动物满足生长发育和繁衍后代的营养食物和清洁的饮水，使其免受饥渴。（吃好喝好）2.应提供给动物适当的栖息之地和饲养场所，使其能休息和睡眠。（休息好）3.应提供预防动物疾病和患病后及时诊疗的措施，使其免受疾病和伤害的痛苦。（健康成长）4.应提供给动物安静的饲养环境，无刺激动物发生应激和恐惧的场面和声音。（平静生活）5.应提供给动物同类一起自由玩耍、表达天性的空间和自由。（表达天性）•饲养繁殖实验动物的目的是用实验动物作为人类的替难者进行各种生物医学研究。一方面随着生物医学的发展，实验动物的使用量逐年增加，使用种类也逐年扩大；另一方面从动物福利和动物实验伦理学考虑，又需要尽量减少一些不必要的动物实验，特别是人类的宠物诸如猫、犬、猴等，或者在不得不做的动物实验中尽可能将动物的痛苦、压迫和不适降到最低。•动物实验的伦理判断标准：1.必须权衡实验的目和得出的结论与动物由此而受到的伤害和死亡。2.必須清楚而且明确「沒有任何替代方法可达到所做的动物实验的目的」这个前提。3.必须将动物的痛苦、压迫和不适减到最低程度。二、动物实验是实践性非常强的技术和方法，不能仅靠书本理论知识，需要通过反复实践加以掌握。目的：•保证实验的顺利进行。•减少动物承受的痛苦。•成为熟练掌握动物实验操作技术的能手或专家应该是大学/研究所每一个动物饲养管理人员所追求的目标。动物实验前的准备1.所用动物实验设施是否符合本实验要求普通设施，清洁级、SPF设施，感染性设施，有毒有害供试品设施，放射性设施实验室、手术室2.所用实验动物的品种、品系、性别、数量等能否得到3.所需要的动物实验技术是否熟练掌握4.所用动物实验器具、试剂是否准备好5.所用的仪器设备是否处于可运行状态6.预实验正式实验前的演习预实验可用少量动物进行预实验结果不能并入正式实验结果一起分析。一、动物的抓取•动物的抓取是顺利进行各项动物实验操作最基本的一个环节。•应熟练掌握各种实验动物的抓取方法，用轻柔的手法把对动物施加的恐惧和痛苦降到最低。•一般说来动物是不会主动攻击人的。1.小鼠抓取的注意点2.大鼠抓取的注意点3.豚鼠抓取的注意点4.兔抓取的注意点•最好戴人造革围裙和袖套，以免爪子抓伤。•采用正确地抓取方法。•可采用兔固定器固定进行实验操作，或一人抓取固定，一人实验操作。豚鼠和兔的抓取5.犬抓取注意点•实验用犬有专用的比格犬和农村收购来的草犬。•犬是通人性的，草犬购入后，饲养人员和实验人员要经常亲近它们，使它放松对你的警惕，容易直接抓取它们。•不要轻易使用长柄铁钳，钳伤造成的伤害会使它对你更加恐惧，影响以后实验的进行。•抓取后用绳子将嘴绑住。二、动物实验分组设计（一）一般动物试验分组设计的基本原则：随机、对照和重复。•随机：就是按照机遇均等的原则来进行分组。其目的是尽量减少各种干扰因素造成的实验误差，不受实验者主观因素或其他偏性误差的影响。•随机化的手段可采用编号卡片抽签法，随机数字表或采用计算器的随机数字键。•对照：是要求在实验中设立可与实验组比较，用以消除各种无关因素影响的对照组。对照应有可比性：同时同地同条件对照设立有两种方式：•自体对照1.实验前后对照2.身体左右对照•组间对照（以手术造成兔腹主动脉损伤动脉粥样硬化模型为例）1.正常（空白）对照组：正常饮食，不做手术2.假手术组：正常饮食，做手术3.模型组：手术+高脂饲料4.已知疗效药物组：手术+高脂饲料+已知疗效药物5.未知疗效药物组：手术+高脂饲料+未知疗效药物6.赋型剂对照：手术+高脂饲料+赋型剂•重复：是指同一处理要设置多个样本数。重复的主要作用是估计试验误差、降低试验误差和增强代表性，提高实验结果的精确度，保证实验结果能在不同个体中稳定地重复出来。•样本数过少，实验处理效应不能充分显示；样本数过多，又会增加实际工作中的困难。因此在进行实验前必须确定最少的样本例数。最少的样本例数可按一般估测方法确定，也可通过统计学方法进行测算确定。（二）动物实验分组设计的基本类型1.完全随机化设计2.按体重分层随机区组设计3.配对设计（二）按体重分层随机区组设计先确定实验的组数，将动物称重，按体重的轻重顺序编号，再用随机化工具，如随机数字表等，将动物随机分配至处理组及对照组。•随机区组法举例•以用四氧嘧啶诱发小鼠糖尿病模型，用药物进行治疗观察疗效为例，实验中可分为5组：正常对照组、模型组、药物治疗低剂量组、高剂量组和已知可治疗糖尿病药物组，每组10只，5雌5雄。按下列步骤进行分组：1）雌雄分开：分组时雌、雄动物分开分别进行。2）用记号笔在小鼠尾巴上随机编1-25号。3）按编号称重，记录每只小鼠的体重。4）按动物体重顺序依次重新编号。5）共5个实验组分成5个区组，每个区组都有5只体重相近的动物。第一区组5只动物为1、2、3、4、5号，第二区组为6、7、8、9、10号，余类推。6）抄录随机数表。抄录数字的个数等于区组数减1，如5个区组就抄录4个数字。第5个动物无随机数字，其分组为调剂。以后的区组按顺序依次抄录数字。7）将小鼠分到各组中。动物编号123456789101112131415随机数字052784374168385156968180除数555555555555余数024213311110组别524311342512354动物编号16171819202122232425随机数字4788745972402363除数55555555余数23442033组别2345125341按体重分层随机区组分组三、动物编号常用的标记方法适用需要个体识别的实验1.染料标记法：适合白色被毛的动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔等。黄色：常用3~5%苦味酸溶液红色：常用0.5%中性红溶液咖啡色:2%硝酸银溶液黑色：煤焦油酒精溶液优点：简单、易识别缺点：长期易退色；不能编大号码。2.剪耳（打孔）法：啮齿类小动物3.号码钳法：适用于兔、犬等大动物4.耳牌法：适用于羊、牛等大家畜5.电子芯片植入法：四、动物被毛的去除方法1.剪毛法：用弯头剪逆毛方向剪适用于各种实验动物2.拔毛法：常用于兔的耳缘静脉注射3.剃毛法：剃须刀、手术刀适用于大动物4.脱毛法：脱毛剂•常用脱毛剂配方配方1：硫化钠8g溶于100mL水中。配方2：硫化钠：肥皂粉：淀粉的比例为3：1：7，再加水调成糊状。配方3：硫化钠10g和生石灰15g溶于100mL水中。•配方1和2适用于家兔和啮齿类动物的脱毛，配方3适合给犬脱毛。•脱毛后用清水将脱毛区清洗干净。五、实验动物的麻醉方法•对实验动物进行麻醉的目的是，消除实验过程中引起的痛苦和不适，确保实验动物的安全和动物实验的顺利进行，是动物实验伦理的一个重要方面。•麻醉方法有全身麻醉和局部麻醉两种。在实验动物的麻醉中绝大多数采用全身麻醉。•应结合实验目的、实验动物种类、日龄及健康状况等因素进行综合考虑，决定选用的麻醉剂和麻醉方法。•全身麻醉简称全麻。全麻是指麻醉药通过呼吸道吸入、静脉和肌肉注射等途径，进入实验动物体内，使其产生短时间意识丧失、痛觉消失、肌肉松弛和反射抑制等中枢神经系统抑制现象。当麻醉药从体内排出或在体内代谢破坏后，实验动物逐渐清醒，不留后遗症。•全麻有吸入麻醉法和注射麻醉法两种途径，吸入麻醉法用挥发性麻醉药，注射麻醉法用非挥发性麻醉药。（1）吸入麻醉法•常用药物为乙醚、氟烷和异氟烷等。吸入麻醉法有开放吸入和气管内插管吸入两种方法。•开放吸入：适用于啮齿类小动物，可用乙醚、氯仿小动物吸入麻醉机国外已有售。•气管内插管：适用于犬、猴、羊等大动物，氟烷和异氟烷是最常用的麻醉药。•吸入麻醉的优点：麻醉平稳、安全可靠、停止吸入后很快苏醒•缺点：需要一定的仪器设备，注意自身防护。大小鼠麻醉法（2）注射麻醉法注射麻醉法是使用非挥发性麻醉药进行全麻的方法。在动物实验中比较常用。常用麻醉药：戊巴比妥钠硫喷妥钠氯氨酮乌拉坦大动物：静脉注射或肌肉注射啮齿类动物：腹腔注射•实验动物麻醉应注意的事项1.大动物麻醉之前应禁食。2.麻醉之前应准确称量动物体重，作为计算麻醉剂用量的依据。3.应注意不同麻醉药对动物的作用是不同的，如戊巴比妥钠、硫贲妥钠等能抑制心肌收缩力，使肌肉松弛，而氯胺酮则相反。4.大动物犬、猴、羊等麻醉前半小时应注射麻醉前给药如阿托品和苯巴比妥钠。5.静脉注射麻醉药是必须缓慢，边注射边观察动物的意识、角膜反射、肌肉紧张性和对疼痛的反应，达到麻醉要求时应停止注射。6.大动物手术时应配备麻醉师，在麻醉过程中密切观察动物的反应，如血压、脉搏、呼吸和体温，及时调节麻醉药剂量，保证手术顺利进行。7.动物在麻醉期间、手术后至苏醒期体温会下降，应注意手术室的室温。8.注意术后护理。•麻醉意外的抢救原因：麻醉药速度过快、剂量过大、麻醉过深后果：中枢神经系统抑制导致呼吸系统、循环系统功能障碍，引起呼吸、心跳停止。抢救方法：要针对具体情况，采取对症治疗的措施。1.立即停止供给麻醉剂2.人工呼吸，吸氧3.苏醒剂4.呼吸中枢兴奋剂如可拉明等和心脏和呼吸兴奋剂，如0.1%肾上腺素适量作心内或静脉注射，静脉滴注50%葡萄糖溶液等。六、实验动物的给药方法•经口给药法•注射法•其它途径给药方法1.呼吸道给药2.皮肤给药3.脊髓腔内给药4.脑内给药5.直肠内给药6.关节腔内给药•经口给药1.拌入饲料、饮水中自由摄取优点：省人力缺点：因个体差异，摄入量不等2.灌胃优点：能准确定量缺点：给动物造成一定的痛苦，需熟练掌握技术大小鼠灌胃注意点1.用灌胃针。2.从嘴角处插入，到达咽部后改变灌胃针的方向，使其与食管的走向一致，然后顺利插入。3.成年大鼠由于体型较大，不易保定。办法：1）一人保定，一人灌胃2）操作者抓取后，将大鼠尾部按在自己的胸部，达到固定尾部的目的，然后灌胃。灌胃量：小鼠0.2-0.4ml/10克，大鼠1.0ml/100克大小鼠灌胃兔灌胃法采用用固定器一人操作，或一人保定一人操作法。操作者用左手拇指和中指挤压家兔两颊，将下颌挤开使兔被动张口，右手将开口器从一侧口角插入口腔并固定，用泡在水中的14号细导尿管，经开口器的孔插入，向前推进约15cm，可达胃内，确认泡在水中的导管另一端没有冒气泡，说明没有误入气管，即可注入药液。灌胃量为每只每次80-150mL。兔灌胃法1.口服给药用右手将口服药片夹在拇指和食指之间，把左手放在犬的圈套上，用拇指和食指压着犬的上唇，用力使犬的头向后仰，继而把右手中指放在犬的下颌向下压。当犬的嘴张大时，快速把药片放在舌根隆起的部位，合上犬的嘴，维持头后仰姿势，右手在咽喉部轻轻按摩。借助犬本能的吞咽动作服下药片。犬的胶囊给药法2.灌胃给药在给犬灌胃时，将犬固定于特制的固定架上，实验时将木制开口器从一侧口角放入犬的口腔，用左手或绳子固定，右手持12号胃管由开口器的小圆孔向咽后壁方向不断插入，导管另一端置于一杯清水中，若连续出现气泡，说明插入呼吸道，应立即拔出胃管，重新操作。如无气泡，说明没有插入气管，插至约20cm，即可到达胃内。犬的灌药量为每只每次200-500mL。犬的灌胃给药法各种动物一次灌胃能耐受的最大容积动物种类体重（g）最大容积（ml）动物种类体重（g）最大容积（ml）小鼠20-241.0豚鼠250-3004-525-301.53006.0302.0兔2kg-2.4kg100大鼠100-1993.02.5kg-3.5kg150200-2494-53.5kg200250-3006.0猫2.5kg-3.0kg50-803008.03.0kg100-050犬1