中医证的动物模型研究思路

中医“证”的动物模型第一节中医证的动物模型研究思路中医证候动物模型是现代中医学研究的基础，是中医动物实验的核心。中医证的动物模型是中药新药有效性评价的工具，可为中药新药研制和开发、中药药理研究提供坚实的实验基础.中医学术发展缓慢的一个重要原因就是实验研究体系不够完善，缺少自己的科学规范、指标体系和方法论。中医证候动物模型的建立可弥补上述缺陷，有利于促进中医药学的现代化。理想动物证候模型制备原则1.症状、病理变化与临床证型相似。临床同一证型可能有多种不同的病理状态；同一证的模型也可有多种原因造成。模型不仅要与证对应，而且要尽可能与特定的病理对应，病因相似。理想动物证候模型制备原则2.代表方药治疗后可纠正上述证候、病理生理变化。治疗效果作为反证以衡量模型是否成功。3.检测指标具有客观性、敏感性、重现性，可定量或半定量。迄今制备“证”的模型主要采用的方法：1.按病因、病机理论建立模型：某些病因、病原可以引起类似于中医某种证的病理生理变化。例如由某些致病菌，毒素引起的疾病，发展到某一阶段都会出现中医描述的“热毒”证。包括面赤身热，口渴便秘或泄泻，小便短赤，舌红苔黄，烦躁不安，甚至神昏谵语等。因此可通过向动物体内注射致病菌，如伤寒，副伤寒，甲，乙三联菌苗，或注射细菌内毒素如大肠杆菌内毒素，伤寒杆菌内毒素等造模。清热解毒药对这一方法产生的病理模型变化具有改善作用。以此方法制备的“热症”模型，可用于评价清热解毒新药的解热作用。再如慢性泄泻可致脾虚，用大黄等给动物长期服用可制备脾虚模型。健脾温中方药可缓解此脾虚证。2.以病拟证：有些疾病发展到某一阶段，某种证的表现比较明显。◆如甲亢患者常见阴虚火旺，五心烦躁，颧红，消瘦等阴虚症状，故可用甲状腺激素制备阴虚模型。中药生地，玄参，麦冬，龟板等给予此模型动物，可改善症状。◆另一方面也可用他巴唑制造阳虚模型。◆贫血患者常表现有血虚，所以用少量多次放血，或用化学药物损伤动物的骨髓造血功能，制备动物模型，能够造成动物疲倦少动，消瘦乏力等与血虚相关的一些表现，以及血液红细胞数下降等与临床血虚病人相似的生理生化变化。用当归补血汤后可改变这些病理生理变化。3.直接模拟证的病理变化：如对证的某些病理变化已有所了解，可直接用药理、化学或物理方法制造这一变化，以形成与该证接近的病理模型。如血瘀证，目前一般认为它主要表现为循环障碍和血液流变学障碍。因此常用一些方法，人为制造微血流淤滞，血液粘度增高，使微循环的血流不畅。病证结合模型研究思路1.同病不同证。如不同方法造成的消化性溃疡病模型对不同的辨证施治方药反应不同，认为其属于不同的证候。又如用肾动脉狭窄法形成的高血压模型属肾阴虚型；高肾上腺皮质激素制备的高血压模型属于肾阳虚型。2.由病致证。如感染性休克在其演变过程中分别发生了热厥证、热厥气脱证、元气外脱证。3.病与证分别发生，但有时间上的同步性。如在建立脾虚模型基础上对动物接种肿瘤细胞株而形成脾虚型肿瘤模型。病证结合模型模拟临床辨证、辨病相结合的情况，是在同一动物体上同时复制具有相互联系的现代医学的病及中医证候，其实质是一类中西医结合模型。病证结合模型增加了模型的变量，使研究的复杂性及提供的信息量均大幅度增长。现有动物证候模型的缺陷1.模拟的病变与真实疾病病理变化存在差异。2.与人类疾病及证候的临床表现不完全相同。3.同一病的证候分型，缺少客观化、可量化检测指标。4.部分模型缺乏稳定性，病理、症状变化可自行缓解。应用注意比较成熟、科学合理的中医证(病)动物模型甚少。大部分尚处于探索阶段。对一个药物的药效需要用几个模型从不同侧面验证。切忌单凭个别动物实验指标的测定结果就作绝对的肯定或否定。第二节现有几种证的动物模型研究简介一、阴虚证造模材料：成年大鼠，200～250g；小鼠，7～8周龄，左旋甲状腺素钠或甲状腺素。造模方法：成年大鼠以甲状腺素1-10mg／kg灌胃，连续3周；或小鼠以L－甲状腺素钠1-20mg／kg皮下注射，连续4～5d。原理：甲状腺功能亢进主要表现为肾阴虚证，通过给实验动物大剂量使用甲状腺素，复制出甲状腺功能亢进性肾阴虚证动物模型。呈现肝、肾组织耗氧量增加等。阴虚证造模后的指标变化：动物出现体重减轻，体温升高，心率加速，躁动不安，饮水量、耗氧量增加，痛阈下降。肝脾核酸合成增加，外周微循环血管开放数目增加，血流加速，心肌、肾脏和脑组织β受体数量均增加；红细胞、肝、肾组织的Na+，K+-ATP酶活性增高。益气养阴泻火药对甲亢动物的影响操作方法：取体重18～28g小鼠，每天以三碘甲状腺氨酸(T3)，1mg／kg灌胃，连续3～5天。益气养阴泻火药复方，制成2g/ml煎剂，于造型同时给予0.6ml／只灌胃。结果，甲亢组肝组织耗氧量较正常组增加，治疗组则降低之。——————————————————————组别血浆cAMP(pmol/ml)肝组织耗氧量——————————————————————对照组71.76±18.94(n=21)385.04±45.36(n＝17)甲亢组98.05±27.09(n=23)*532.10±71.02(n=17)*治疗组80.89±31.11(n=17)465.03±109.07(n＝15)△*—————————————————————————————*与对照组比p0.01△与甲亢组比p0.05肝组织耗氧量：每分钟毫微克分子氧／100mg肝组织糖皮质激素型阴虚模型建立法原理:临床使用糖皮质激素治疗时，可发生欣快、失眠，不安，易激动的副作用，这些症状与阴虚类似。动物实验发现大剂量醋酸可的松对甲状腺的作用是先促进后抑制。在用大剂量氢化可的松制作小鼠阳虚造型时，发现助阳药对造型早期无效，滋阴药有一定作用。在造型后期则助阳药有效，滋阴药无效。因而显示氢化可的松造型早期为阴虚表现。二、阳虚证模型阳虚则阴盛，阳虚则外寒。因此凡属阳虚证者，均有寒象。阳虚有肾阳虚、脾阳虚等。由于肾为先天之本，又为气之根。因此一般阳虚证常涉及肾阳虚。补阳都从补肾入手，补阳药一般也都是补肾阳的药物。肾阳虚的主要表现是全身功能衰退，一般症状有神倦，畏寒肢冷，腰膝酸软，舌质淡白，脉沉而弱。因此实验动物模型大都根据这些原理设计。阳虚证的发生原理，尚未完全阐明。根据临床和实验资料，认为与内分泌功能和能量代谢失调有关。造模材料：小鼠，雄性，体重25～35g，醋酸氢化可的松注射液或可的松、氢化可的松注射液或地塞米松。造模方法：可的松或氢化可的松给小鼠灌服，或肌肉注射15～30mg/kg，每天1次，连续5～7d;或给小鼠以醋酸氢化可的松25～62.5mg/kg肌肉注射，连续8～10d。造模原理：大剂量氢化可的松促进动物蛋白质、脂肪的大量分解，“阳虚”大鼠血浆ACTH含量昼夜总体水平显著降低，垂体、肾上腺、生殖腺组织发生退行性病变，肝、脾重量减轻，RNA和DNA合成减少，细胞免疫和体液免疫功能降低，外周微循环血管开放数目减少，血浆cGMP水平增高，cAMP水平相对降低，血浆皮质醇水平增高，肝糖原增加。阳虚证造模后的指标变化：阳虚小鼠模型建成后，小鼠出现的“阳虚”症状：厌食，体重减轻、活动减少、反应迟钝、卷曲拱背、形寒肢冷、耗氧量减少。游泳能力和耐冻能力减低，且死亡率随造型天数而增加。例：肾阳虚模型组：氢化可的松25mg/kg肌内注射)；生精胶囊大、中、小剂量组：生精胶囊2.4、1.2、0.6/kg，口服；同时肌内注射氢花可的松25mg/kg；五子衍宗丸组：五子衍宗九1.2g/kg，口服。同时肌内注射氢花可的松25mg/kg，每日1次，连续4次。组别剂量体重（g）游泳时间(g/kg)药前药后（min）正常对照组28.9±0.9832.7±4.125.4±3.0模型组28.9±0.8729.8±1.6*20.3±3.3**生精胶囊2.427.8±0.7932.6±1.6ΔΔ23.24±2.9Δ*1.226.4±0.9432.4±2.723.8±4.80.627.0±1.032.3±1.8Δ23.7±3.9Δ五子衍宗丸1.226.4±1.232.6±2.4ΔΔ23.1±4.3生精胶囊对肾阳虚模型小鼠的影响(X±s；n＝l0)注：与正常对照组比较*P0.05，**P0.01；Δ与模型组比较P0.05，ΔΔP0.01。羟基脲型阳虚模型建立法原理阳虚动物的虚损表现与核酸代谢，特别是脱氧核糖核酸(DNA)代谢低下有关。抗肿瘤药羟基脲能抑制核苷酸还原酶，从而抑制DNA合成，影响蛋白质代谢，出现一系列虚损症状。操作方法取体重22～28g雄性小鼠。以羟基脲5～15mg／只灌胃。连续7～15日，可出现阳虚症状（以7.5mg较为合适）。例：取小鼠以羟基脲7.5mg／只，灌胃造型，治疗组以补阳药(淫羊藿和肉苁蓉等量制成煎剂，浓度为生药1g／ml，煎剂0.5ml／只，连续给药13日。末次给药后每只小鼠腹腔注射氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR)6微居里，1h后取动物肝、脾，测定DNA合成速率。结果：与阳虚组比较，补阳组肝脾DNA合成率较高，体重增加，耐冻时间较长。补阳药对阳虚小鼠的影响(x±s)增重耐冻时间(min)肝脾DNA合成率对照组6.5±0.94170.2±15.5(n=9)11560±1980(n=8)阳虚组－1.1±0.74*△119.5±6.7**(n=l0)5600±848*(n=8)治疗组5.4±1.23206.0±12.3△(n=10)9900±1660△(n=9)与对照组比，*P0.05；与对照组比，**P0.01；△与阳虚组比P0.01。DNA合成率单位为每分钟cpm／mg·DNA肝、脾DNA测定原理分别取出肝、脾，用冷生理盐水洗净，滤纸吸干表面水分，称重，在冰浴中剪碎，加冷匀浆液（0.15mol/LNaCl,0.1mol/LEDTA,pH7.5-8.0），制备匀浆，以纱布过滤，3500r/min离心15min。取沉淀加入2ml匀浆液，搅匀，放置达室温，加入纯化的十二烷基磺酸钠(SDS),使其终浓度为1.6％。于三角烧瓶中加玻璃珠振荡摇匀，再加固体氯化钠，浓度达1mol/L,振荡20min,再加等体积氯仿，剧烈振荡20min,3500r/min离心15min。上层水加入2倍体积无水乙醇，即可见DNA呈胶链析出。用玻璃棒卷出此白色纤维状粗制DNA，以丙酮、乙醚冲洗，干燥后称重。取4－9mgDNA，加闪烁液，用液体闪烁计数仪测定脉冲值，按1mgDNA每1min的脉冲值计算。甲减型阳虚模型建立法切除甲状腺造型法原理甲状腺功能减退者(甲减)，体内的代谢普遍减慢，基础代谢率降低，中医辨证甲减患者大多具有脾肾阳虚症状，以温肾补阳药治疗，临床症状好转，基础代谢率升高，血浆cAMP升高。因此切除甲状腺造成的“甲减”动物模型，可模拟人类的阳虚证。操作方法取体重100～150g大鼠。在乙醚麻醉下切除双侧甲状腺，造成甲减大鼠模型，手术6～8星期后用于实验。三、血瘀证动物模型1．高分子右旋糖酐静脉注射造模法造模材料：高分子右旋糖酐又名高分子葡聚糖，平均分子量为20万～40万；家兔或新西兰大白兔。造模方法：高分子右旋糖酐，经加热，使完全溶解于生理盐水中，配成10％浓度的溶液。用9号针头经耳缘静脉，以15ml/kg的剂量快速注入10％高分子右旋糖酐，全量应在3min内推注完毕。一般在推注到全量1／3左右时，微循环中即出现以血细胞聚集为主的各种微循环障碍表现，并可持续12～24h。造模原理：高分子右旋糖酐能被红细胞吸附，从而在红细胞间起着桥梁作用，导致红细胞聚集，血流阻力增加，循环不畅。造模后的指标变化：除出现口唇紫绀，舌质暗红等血瘀症状外，还可见体内微循环血流缓慢、血细胞聚集、微血管周围有渗出及出血等现象，血黏度升高、红细胞电泳时间延长等明显的微循环障碍特征。家兔连续灌胃(ig)给绞股蓝总甙或水7d，每天1次。在给药到第7d，由家兔耳缘静注10％高分子右旋醣酐