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血红蛋白的提取与分离二、实验操作－－实验步骤血液组成成分（1）洗涤红细胞（2）释放血红蛋白（3）分离血红蛋白（4）透析血红蛋白1、样品处理3、纯化4、纯度鉴定2、粗分离SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度凝胶色谱法进行纯化注意事项1.分离生物大分子的基本思路：选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。2.蛋白质分离和提取的原理：根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。基础知识3、提取分离方法凝胶色谱法凝胶电泳法基础知识2.凝胶：大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。根据被分离的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。1.概念：（一）凝胶色谱法（分配色谱法）基础知识（一）凝胶色谱法（分配色谱法）3.凝胶色谱法的原理①当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;②而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。③依据的特性是：蛋白质分子量的大小。3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（），移动速度（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（），移动速度（），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。相对分子质量较小较长较慢相对分子质量较大凝胶外部较短较快总结：大分子经过路程短，流动快；小分子经过路程长，流动慢。分子量大小直径大小大于凝胶颗粒空隙直径，被阻挡在颗粒的外面小于凝胶颗粒空隙直径，可以进入颗粒内部运动方式垂直向下移动垂直向下移动，无规则扩散进入颗粒内部运动速度较快较慢运动路径较短较长洗脱次序先从凝胶柱洗脱出来后从凝胶柱洗脱出来一、基础知识---蛋白质分离和提取的原理•用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质•A．路程较长，移动速度较慢B．路程较长，移动速度较快•C．路程较短，移动速度较慢D．路程较短，移动速度较快D洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。混合物上柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收集大分子收集小分子4、具体过程凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示（二）缓冲溶液1.概念:在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。2.作用:基础知识•相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个•B（二）缓冲溶液基础知识3.缓冲溶液的配制:通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。4.提问：在本课题中使用的缓冲液是:____,其目的是:利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)磷酸缓冲液（三）电泳：1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.原理：①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。基础知识影响蛋白质分子运动速度的因素决定运动方向形成库仑力形成阻力决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小√√√√√√√3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图聚丙烯酰胺凝胶电泳1、测定蛋白质分子量:常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。2.原理：SDS能使蛋白质发生完全变性。解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。3.SDS作用机理:用SDS测定蛋白质分子量的方法使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。电泳检测结果琼脂糖凝胶电泳使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A电荷的多少B分子的大小C肽链的多少D分子形状的差异实验操作样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定1.样品处理：（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。血液血浆水分固体物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁血红素基团2.提问：血液有哪些成分？1.提问：用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。血红蛋白两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁血红素基团每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子O2或一分子CO2，血红蛋白因含有血红素而呈红色。血红蛋白的特点：1.洗涤红细胞阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的方法是什么？洗涤干净的标志是什么？血液100mL3g柠檬酸钠低速短时间离心红细胞血浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有黄色(1)红细胞的洗涤:去除杂质蛋白，利于后续血红蛋白的分离纯化.1、采集血样2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4、盐水洗涤：下层暗红色的红细胞+五倍体积的0.9％的NaCl溶液洗涤，搅拌10min5、低速短时间离心：6、重复3、4、5步骤三次上清液中已没有黄色：红细胞洗涤干净。①目的:②操作：洗涤次数过少,无法除去血浆蛋白。2.释放血红蛋白阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质，有什么用？目的分析：1.蒸馏水的作用是______________________________。2.加入甲苯的作用是____________________________。3.充分搅拌的目的是____________________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂(3)分离血红蛋白溶液：①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min。②试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。③分离：滤纸过滤：除去脂溶性沉淀层，分液漏斗中静置：分出下层的红色透明液体。滤纸过滤脂类物质3.分离血红蛋白分离过程红细胞混合液高速离心10min离心管烧杯有机溶剂血红蛋白甲苯层（无色透明）白色薄层固体红色透明液体杂质沉淀层（暗红色）试管中溶液层次(4)透析：①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12h②目的：除去样品中分子量较小的杂质和离子。或用于更换样品的缓冲液。20mmol/L磷酸缓冲液1mL透析过程动画演示2.凝胶色谱操作:（1）凝胶色谱柱的制作：①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。（2）凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。2.凝胶色谱操作:③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀注意：1、装填时尽量紧密：降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。④洗涤平衡：连接缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12h。注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响分离效果2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。（2）凝胶色谱柱的装填50cm高（3）样品加入与洗脱①调节缓冲液面：打开下端出口，使缓冲液下降到与凝胶面平齐，关闭出口②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，注意：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样3、吸管管口贴着管壁环绕移动加样③样品渗入凝胶床：打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口④洗脱：加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）（3）样品加入与洗脱注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。收集得到的纯化后的蛋白思考下面的问题：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能正常。1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？2、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行血红蛋白的分离有什么启示？血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。观察处理的血液样品离心后是否分层，如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。实验结果分析与评价1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？1、由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。2、加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。3、色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。血红蛋白提取和分离的程序包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。样品的处理：通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，样品的粗分离:透析→去除分子量较小的杂质样品的纯化：凝胶色谱法→除去相对分子质量较大的杂质蛋白纯度鉴定:聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。