载体

基因工程的载体载体的特征：在寄主细胞中能够自主复制；有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点插入外源基因片段；在基因组中有遗传标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征；载体分子较小，以便体外基因操作；对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件；载体的类型质粒噬菌体其他载体(如:酵母人工染色体、细菌人工染色体、植物Ti质粒、动物病毒)质粒(plasmid):多数情况下,质粒是存在于细菌染色体外的小的双链闭合环状DNA分子，能自主复制，并在细胞分裂时遗传给子代细胞并不是所有的质粒都是环状分子,在多种细菌中都发现有线性质粒质粒广泛存在于原核生物中,其大小从相对分子量小于1X106到大于200X106质粒的形态1)cccDNA—双链闭合环状DNA2)ocDNA—开环DNA3)cDNA—线形DNA（L型）在DNA促旋酶（gyrase）作用下成负超螺旋构型,在拓扑异构酶I的作用下解旋。溴化乙锭（ethidiumbromide，EtBr）也有解旋作用溴化乙锭插入DNA超螺旋的作用随着插入的溴化乙锭数目增加,双螺旋解旋,导致超螺旋减少直至产生环状分子的开放形式.进一步的插入在双螺旋中引入了过多的螺旋,导致反义的超螺旋(注意B和D处的螺旋方向).为了清楚起见,只表示了双螺旋的一条单链质粒DNA的复制类型严紧型质粒这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝松弛型质粒这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于严紧型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数穿梭载体（shuttlevector)可以在两种生物体内复制的载体分子质粒的命名规则小写字母p表示质粒（plasmid)p后面的两个大写字母表示发现或者构建该质粒的作者或者实验室名称数字表示编号例：pBR322、pET21、pGEM-T质粒的宿主范围质粒只编码少数几个其自身复制所需要的蛋白质,甚至在许多情况下只编码其中一个蛋白质所有其他复制所需的蛋白,包括DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶等都是由宿主细胞提供的质粒所编码的复制蛋白质定位在ori附近，因此只有ori周围的一小部分区域是复制所必需的因此，把质粒的其他部分删除掉，把外源序列加到质粒上，复制仍然可以继续进行质粒的宿主范围是由它的ori决定的质粒的不相容性在没有选择压力的情况下，两种质粒不能共存于同一个宿主细胞内如果质粒拥有相同的复制调控机制，它们就不相容显性质粒和隐蔽质粒显性质粒(表达型质粒)----除了携带与本身复制和转移有关的基因外,还携带一些其他的基因,宿主细胞由于含有这样的质粒而呈现出新的性状,这样的质粒称为显性质粒隐蔽质粒----无异常性状表现出来克隆载体例：pBR322、pUC18、pUC19、pGEM-T表达载体例：pET-21、pGEX质粒DNA的制备碱裂解法、煮沸法、层析柱过滤法碱裂解法原理：在高pH的碱性条件下，染色体DNA和蛋白质变性，质粒DNA由于其超螺旋共价闭合环状结构，尽管其DNA的大部分氢键也断裂，但是双链DNA仍然不会分离，当恢复到中性时，染色体DNA复性，并聚集形成不可溶的网架。在裂解过程中，变性的蛋白质和染色体DNA相互缠绕在一起，并与SDS形成复合物，通过离心一起沉淀下来而被除去，然后使用不含DNA酶的RNase除去RNA，即可得到质粒DNA层析柱过滤法特制的微型离心纯化柱硅胶膜(silicamembrane)高盐浓度下可以结合20ug的DNA可以通过小体积的水或者低离子强度的缓冲液将DNA洗脱出来质粒的产量受几个因素的影响：1）细胞收获时实际所含有的拷贝数2）制备手段（最重要的是裂解是否充分）3）宿主细胞中endA基因也会影响质粒的产量endA基因的产物是内切酶I，它的底物是双链DNA从含有endA基因突变的菌株（endA-）中提取的质粒，其稳定性和产量都有提高作为载体的质粒一般具有以下特点分子相对较小（３∽１０kb）松驰型复制具有适当的多克隆位点MCS（multi-cloningsite），以便外源DNA插入具有抗生素抗性或者插入失活筛选标志，便于从平板上直接筛选阳性重组子质粒克隆载体的构建原则1)选用合适的出发质粒2)正确获得构建质粒克隆载体的元件3)组装合适的选择标记基因4)选用合适的启动子5)在能达到预期目的的前提下,构建质粒克隆载体的过程力求简单噬菌体载体λ噬菌体载体Ｍ13丝状噬菌体载体λ噬菌体载体：λ噬菌体是一种遗传上很复杂、但是得到了广泛研究的大肠杆菌病毒λ噬菌体是一种双链DNA噬菌体，基因组约为50kb线性λ噬菌体DNA分子的两端各有12个碱基的互补单链序列，是天然的粘性末端，称为COS位点DNA在注射到宿主细胞中时就利用这些突出形成一种环状结构噬菌体分为：烈性噬菌体和温和噬菌体λ噬菌体的生活周期：溶菌（裂解）生长时在平皿上形成清亮的噬菌斑；溶源性生长（噬菌体DNA整合到宿主细胞染色体上，随之复制，也存在非整合型噬菌体DNA）已构建的λ噬菌体载体分为两类：置换型载体：有两个酶切位点或两组排列相反的多克隆位点，其间的DNA片段可被外源DNA置换。这类载体适于克隆5-20kb的外源基因片段，常用于构建基因组DNA文库插入型载体：只有一个限制性内切酶位点或一组多克隆位点可供外源基因插入。这类载体允许插入5-7kb的外源DNA,适于构建cDNA文库。如λgt噬菌体载体一般将噬菌体DNA在体外包装成病毒颗粒后再用于感染受体菌，这样能大大提高转染效率Ｍ13丝状噬菌体载体Ｍ13基因组大小为6407bp，它是一种闭环的单链DNA分子在感染细菌后呈双链复制型DNA。因此用作克隆载体的双链DNA可从细菌中分离得到。在细菌中，双链DNA复制100-200拷贝后就大量产生单链DNA,后者包装成子代噬菌体颗粒，分泌到细胞外，而不裂解细菌为什么使用单链载体--丝状噬菌体的优势（1）是通过双链环状DNA（RF）的中间体进行复制的，因此可以纯化这种双链环状DNA并且在体外操作，就如同一个质粒一样（2）双链环状DNA和单链DNA都可以转染感受态大肠杆菌细胞，产生感染的菌落（3）噬菌体粒子的大小是受病毒DNA大小控制的（4）单链DNA形式容易获得将M13噬菌体改造成克隆载体插入大肠杆菌的lac操纵子片段和选择标记加入多克隆位点在M13基因组中含507个核苷酸的非必需区，在这个区域插入外源DNA不会影响M13的繁殖和生存，现在使用的M13载体如M13mp18等均为对此区域进行改造而获得。M13克隆的最大问题是不能插入较大的外源DNA片段（一般1000bp）。但M13载体的优点是从细菌中释放出来的噬菌体颗粒中含有一条与克隆的模板DNA互补的单链，所以最适合于制备DNA测序时用的单链模板，另外也可用于制备单链特异性DNA探针。用于克隆大片段的载体柯斯质粒载体酵母人工染色体载体细菌人工染色体P1噬菌体载体P1人工染色体载体柯斯质粒载体（粘粒载体，cosmid）柯斯质粒（粘粒）是指含有λ噬菌体粘性末端的杂种质粒，由λDNA的cos区(约20-数百bp)与质粒重组而成。大小：一般5-7kb左右cos序列是噬菌体DNA中将DNA包装到噬菌体颗粒中所需的DNA序列粘粒的结构特点：抗药性标记质粒复制起始位点一个或多个单一限制酶切位点带有λ噬菌体粘性末端分子小,可容纳大到40-50kb的外源DNA片段，因此适于构建真核生物基因组DNA文库缺点：载体自连、限制性酶切真核基因的随机连接(1)可以使重组DNA象λ噬菌体DNA一样被噬菌体包装蛋白包装；(2)可以将重组DNA携带到细菌细胞中去（有感染力）；(3)可以象质粒一样在细菌中复制（不能象噬菌体一样复制，因为没有噬菌体的复制起点DNA）；酵母人工染色体载体酵母菌是研究真核生物DNA的复制、重组、基因表达及调控的理想材料酵母人工染色体（yeastartificialchromosome,YAC)是结构上模拟真正酵母染色体的线状DNA分子酵母人工染色体可携带长达200-1000kb的DNA片段，因此在人基因组DNA大片段的克隆中非常有用，是染色体克隆排序的主要工具酵母人工染色体由酵母染色体的着丝粒(cen)、自主复制序列(ARS)和来自四膜虫的端粒(Tel)等功能性DNA序列组成自主复制序列(ARS)：适合酵母的DNA复制起始位点着丝粒(Cen）：分裂时保证染色体能正确进入子代细胞端粒(Tel)：确保染色体完整性，维持染色体成为线状用酵母人工染色体克隆DNA的过程与λ噬菌体相似，将DNA大片段与载体的两臂相联，然后将连接混合物转化进酵母细胞中，利用载体上的选择性标记进行筛选YAC上有三个选择性的标记：色氨酸合成酶基因（TPR1)尿嘧啶合成酶基因（URA3）被SmaI位点插入的SUP4标记在加入外援DNA之前，YAC克隆为环形插入外援片段时，酶切处理为线性(两段，称为两个“臂”），由端粒保持其稳定性酵母人工染色体缺点1.稳定性差，插入片段存在丢失和重排现象2.存在着嵌合现象（一个YAC克隆中的插入片段可能来自两个或多个不同的片段，打乱了原有的序列）3.插入片段的分离和纯化困难4.转化效率低人工染色体克隆载体实际上是一种穿梭载体:含有质粒克隆载体所必备的第一受体—大肠杆菌源质粒复制起点(ori),还含有第二受体（如酵母菌）染色体DNA着丝点、端粒和复制起点位点的序列、以及合适的选择标记基因载体可以在第一受体细胞内按质粒复制形式进行高拷贝复制在与目的DNA片段重组后，转化受体细胞，可以在转化的细胞内按染色体DNA复制形式进行复制和传递筛选：筛选第一受体的克隆子，一般选用抗生素筛选标记；而筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补的营养缺陷型细菌人工染色体（BAC）细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome,BAC)是一些环状DNA分子与YAC相似，BAC没有包装限制，因此能容纳较大的外源DNA，平均大小为120kb，个别的可以达到300kbBAC载体与常规克隆载体的核心区别在于其复制单元的特殊性其复制单元来自F质粒，包括严谨型控制的复制区oriS、启动DNA复制的由ATP驱动的解旋酶（repE)以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座（parA、parB、parC）低拷贝标记基因为氯霉素抗性基因可以通过α-互补原理筛选P1噬菌体载体基因组大小为110kb,两端各有约10kb的冗余序列当噬菌体基因组进入宿主细胞后，在冗余序列之间发生重组，从而形成环状基因组，其后噬菌体进入溶原或者裂解状态P1噬菌体载体是与粘粒载体工作原理比较相似的一种高容量载体，含有很多P1噬菌体的顺式作用元件，能容纳70-100kb大小的基因组DNA片段P1噬菌体载体载体组成P1噬菌体载体是以质粒形式提供的pAd10sacBⅡ是常用的P1噬菌体载体大小：30.3kb组成包括：复制元件环化和包装信号标记基因（卡那霉素抗性）克隆位点填充片段（含有一段11kb的腺病毒DNA填充片段，当外源DNA片段的长度不够时可充当噬菌体的头部）P1人工染色体载体（PAC）PAC载体结合了P1载体和BAC载体的最佳特性，相当于P1噬菌体的改进载体插入片段大小在130-150kb之间外源片段出现嵌合和重组的概率很低高容量的载体在使用中如何选择？载体的容量使用的经验文库保存和筛选的难易程度克隆序列的稳定性特殊用途载体启动子探针型克隆载体诱导型表达克隆载体反义表达克隆载体组织特异性表达克隆载体分泌型表达克隆载体含增强子表达克隆载体简化蛋白纯化的载体最大量合成蛋白质的载体