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基因重组宋成义博士/副教授2020/3/312主要内容基因重组–同源重组–位点特异性重组–转座重组–拷贝选择2020/3/313第一节基因重组概述第二节同源重组第三节位点特异性重组第四节转座重组2020/3/314一、定义：二、意义：第一节基因重组概述是指由于不同DNA链的断裂和连接而产生的DNA片段的交换、插入等的重新组合，形成新的DNA分子的过程。重组是遗传学的灵魂，没有重组就没有生物的进化；没有重组也就没有现代的分子克隆技术。基因变化、物种演变、进化的基础2020/3/315三、遗传重组的类型2020/3/316同源重组（Homologousrecombination）涉及两条携带同样遗传位点的染色体间的DNA序列交换。位点特异性重组（Site-specificrecombination）发生在两个特异序列之间。转座重组（Transposition）指的是转座子移到基因组的新位点。拷贝选择（Copychoice）是一种RNA病毒使用的重组。2020/3/317第二节同源重组1.定义2.特性3.真核生物的同源重组4.原核生物的同源重组2020/3/3181.同源重组定义：•同源重组（HomologusRecombination)是指发生在姐妹染色单体（sisterchromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。2020/3/3192.同源重组特性：同源性，无特异性的要求，重组就可以在此序列中的任何一点发生。同源区越长越有利，同源区太短，越难发生重组;只要同源序列足够长，那么即使相差仅1bp的不同的遗传标记，仍然可能发生重组2020/3/3110大肠杆菌重组:至少要求有20—40bp是相同的大肠杆菌基因组与噬菌体或质粒重组:大于13bp枯草杆菌基因组与质粒重组:大于70bp哺乳动物重组:150bp以上2020/3/3111同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。同源重组可以双向交换DNA分子，也可以单向转移DNA分子，后者又被称为基因转换（GeneConversion)。2020/3/3112原核生物的同源重组通常发生在DNA复制过程中，而真核生物的同源重组则常见于细胞周期的S期之后。重组热点:一些序列发生重组的频率高于其他序列真核生物的染色质状态影响重组，如异染色质及其附近区域很少发生重组。在真核生物中，双链DNA分子间基因重组是完成减数分裂所必需的2020/3/31133.真核生物的同源重组模型•Hollidaymodel，相互侵入（交换）模型–RobinHolliday于1964年提出了重组的杂和DNA模型，又称Holliday模型。解释了交互重组现象：对称的杂合双链Meselson-Raddingmodel（单链侵入模型）–Holliday模型中为对称的杂合双链，而实际情况有不均等分离现象，1975年Meselson-Radding提出模型解释这种不对称重组现象：–交互重组和基因转换Double-strandbreaksinitiaterecombination（双链断裂重组模型）2020/3/3114Hollidaymodel2020/3/31152020/3/3116Meselson-Radding（单链侵入模型）Holliday模型中为对称的杂合双链，而实际情况有不均等分离现象，1975年Meselson-Radding提出模型解释这种不对称重组现象：2020/3/31171.在两个DNA分子中的一个单链发生断裂2.游离出一个单链末端侵人到另一个DNA分子中。2.被切割的DNA留下的缺口由DNA聚合酶进行修复。3.在另一个DNA分子中被替代的链降解，而两个末端被连接。4.开始，一个异源双链将只在两个DNA分子中的一个形成，支链迁移将在另一个DNA分子上产生另一个异源双链。像在Holliday模型一样，异构化使两侧的DNA分子重组。通过这个模型，异源双链首先只在两个DNA分子中的一个形成。然后一旦Holliday连接体形成，支链迁移能在另一个DNA分子上产生异源双链。（单链侵入模型）2020/3/3118Double-strandbreaksinitiaterecombination(双链断裂重组模型)•虽然Holliday模型以及随后的Meselson和Radding所作的修改可以解释生物中发生的大多数同源重组事件，但仍有一些例外的重组现象，最典型的例子为基因转换(geneconversion)。•基因转换首先在酵母及真菌中被发现，现已证实在许多生物中存在。•一种等位基因形式转变为另一种等位基因形式，只发生在减数分裂时期。2020/3/3119异常分离与基因转变在一个杂合体中，如果一染色体把基因A交给它的同源染色体，则它的同源染色体必定把基因a交回给它，所以在真菌中，一个座位上的两等位基因分离时，应该呈现2：2或1：1：1：1或1：2：1的分离(表8-1)，这就说明重组通常总是交互的。可是Lindegren在面包酵母（Saccharomycescerevisiae）中发现，有的子囊含有（3A+1a）或（1A＋3a）的子囊孢子。以后在脉孢霉、酿酒酵母、子囊菌Ascobolusimmersus及果蝇中也发现这种现象。2020/3/31202020/3/3121同源重组机制的应用:基因敲除小鼠2020/3/31224.原核生物的同源重组细菌同源重组的特点细菌的接合、转化以及转导重组都是同源重组，而且这种重组是发生在一个完整的环状双螺旋DNA分子与一个双链或单链DNA分子片段之间的。且重组需要3种基因所编码的RecA和RecBCD蛋白质。2020/3/3123A、转化（transformation）•①概念：受体菌直接摄取供体菌裂解后游离的DNA片段而获得新性状。•转化因子：在转化过程中转化的DNA片段。分子量＜1×107,≯10-20个基因。2020/3/3124②机制：感受态受体菌摄取同源DNA后发生重组+吸附摄入重组突变株DNA受体2020/3/3125B、接合（conjugation）•①概念：通过性菌毛连接沟通，将遗传物质（质粒或染色体DNA)从供体菌转移给受体菌的过程。•接合性质粒：F质粒、R质粒、Col质粒、Vi质粒•非接合性质粒(不要求)：•②机制2020/3/3126电镜下的接合F－菌F＋菌2020/3/3127F质粒的接合•F-菌F+菌F-菌F+菌F-菌F+菌F+菌F+菌性菌毛末端-受体接合桥形成F质粒形成切口，一条DNA链进入受体菌内F质粒留在供体细胞的一条链进行复制并形成互补链2020/3/3128F＋F＋F＋F-F质粒的接合2020/3/3129C、转导（Transduction）1）概念：以温和噬菌体为载体，将供菌体的一段DNA转移到受体菌体内，使受体菌获得新的性状。2）类型局限性转导/特异性转导普通性转导2020/3/3130普遍性转导(generalizedtransduction):•噬菌体转导供体菌染色体上全部DNA片段，发生于裂解期。•完全转导：供体菌DNA片段与受体菌染色•体整合并随之传代。•流产转导：供体菌DNA片段不与受体菌染•色体整合也不可自我复制。（大多为此）2020/3/3131细菌裂解期细菌DNA（将供菌任意DNA装配）噬菌体DNA普遍性转导模式图整合未整合完全转导流产转导细菌被普遍性转导噬菌体感染2020/3/3132局限性转导(restrictedtransduction)32•前噬菌体从宿主菌染色体上脱离时发生偏差，将前噬菌体两侧的宿主染色体基因转移到受体菌，使受体菌的遗传性状发生改变的过程•噬菌体转导供体菌染色体上特定部位的DNA片段,发生于溶原期•噬菌体将自身一段DNA留在供菌染色体上，却将相邻供菌的部分DNA带给受菌并整合至受体菌染色体上2020/3/313333局限性转导模式图正常脱离断裂和再接断裂和再接偏差脱离galgalgalgalbiobiobiobio2020/3/3134RecA和RecBCD系统重组机制1.RecBCD蛋白在chi位点3’侧的一条链上产生切口。2.RecBCD蛋白同时具有解螺旋酶的活性，使chi位点附件切口的DNA解链3.单链区被RecA蛋白和SSB蛋白覆盖4.RecA蛋白使单链DNA取代双链DNA中的同源部分5.D－loop区域的DNA产生切口，新切口的3’端（thetailofnewlynickedDNA）与另一条DNA的单链区互补配对6.DNA连接酶封闭切口，形成Hollidayjunction7.RuvA和RuvB发动迁移反应8.RuvC拆分重组中间体2020/3/3135第三节位点特异性重组•定义：发生在专一序列而顺序极少相同的DNA分子间的重组。•如噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组。2020/3/3136•特性–这类重组依赖于小范围同源序列的联会，重组事件只涉及特定位置的短同源区或是特定的碱基序列之间，–重组的蛋白不是rec系统而是int等，如噬菌体l的定点插入。–重组时发生精确的切割、连接反应，DNA不失去、不合成。–两个DNA分子并不进行对等的交换，有时是一个DNA分子整合到另一个DNA分子上，因此将这种形式的重组又称为插入重组。2020/3/3137例、噬菌体的对E.coli的整合：POP’+BOB’→BOP’—POB’需要整合酶(Int—拓扑异构酶活性)和整合宿主因子(IHF)参与,非可逆反应。2020/3/3138通过attP和attB间的相互重组，环状的噬菌体DNA转换为整合的原噬菌体，原噬菌体通过attL和attR间的相互重组而切除A.具有对特异性DNA强烈亲和力的Int与attP和attB位点结合；B.Int的拓扑异构酶活性，使两条双链各自断开一条单链，瞬间旋转然后交换连接，形成Holliday中间提，C.在另两条单链之间发生同样的断裂重接，从而完成双链间的重组。2020/3/31392020/3/3140三类位点特异性重组系统的重组酶Cre、FLP和R均属于λ整合酶家族•Cre/loxP系统•FLP/FRT系统•R/RS系统•Ⅰ/SceⅠ系统等位点特异性重组系统2020/3/3141GATEWAYCloning2020/3/31422020/3/31432020/3/3144CreandloxPmousestrainsCreexpressingstrains:containatransgenethatexpressescreunderthecontrolofawidespread(general)ortissue-specific(conditional)promoter.Theyareusedtoproducegeneralorconditionalknockoutsrespectively.InducibleCrestrains:containatransgenethatexpressesamodifiedformofCrerecombinasethatisnon-functionaluntilaninducingagent(suchasdoxycycline,tetracycline,RU486,ortamoxifen)isadministeredatadesiredtimepointinembryonicdevelopmentoradultlifeLoxP-flanked(floxed)strains:containloxPsitesflanking(oneachsideof)acriticalportionofatargetgeneorgenomicregionofinterestCrerepoterstrains:containloxPsitesincombinationwithvisible(fluorescentorlacZ)markerproteinsusedt