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定向基因改造设想设想一能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？能否让细菌“吐出”蚕丝？设想二能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？设想三经过多年的努力，科学家于20世纪70年代创立了可以定向改造生物的新技术——基因工程。基因工程，又叫DNA重组技术。是指按照人们的愿望，在DNA分子水平上进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。什么是基因工程?一、基因工程的概念基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程实质(原理)结果基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平人类需要的基因产物剪切→拼接→导入→表达基因重组优点：⑴定向改造生物性状⑵克服远缘杂交不亲和的障碍⑶育种周期短1、DNA是遗传物质。2、DNA的双螺旋结构3、中心法则的提出4、遗传密码的破译二、基因工程的诞生（一）理论基础：1)基因转移载体——质粒的发现2)多种限制酶、连接酶，以及逆转录酶（工具酶）的发现3)DNA合成和测序技术的发明4)DNA体外重组的实现5)重组DNA表达实验的成功6)第一例转基因动物问世7)PCR技术的发明（二）技术发明：三、基因工程的原理1、不同生物DNA分子得以重新拼接的基础（1）DNA分子的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。（2）DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。（3）所有DNA碱基互补配对方式相同。2、外源DNA在受体内表达的基础（1）基因是控制生物性状的基本单位，具有相对独立性。（2）遗传信息的传递都遵循中心法则。（3）生物界共用一套遗传密码。基因工程培育抗虫棉的简要过程：在以上过程中关键步骤或难点是什么？普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因通过运载体导入转基因棉花含抗虫基因转基因棉花产生伴胞晶体转基因棉花有抗虫特性关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与运载体DNA连接关键步骤三：抗虫基因导入受体(棉花)细胞剪切→拼接→导入→表达解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来抗虫基因与棉花DNA“缝合”抗虫基因进入棉花细胞“分子手术刀”——限制性核酸内切酶“分子缝合针”——DNA连接酶“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体关键步骤二：关键步骤三：DNA重组技术的基本工具㈠限制性核酸内切酶——“分子手术刀”①来源：主要从原核生物中分离纯化出来。②种类：已从近300种微生物中分离出4000种限制酶。③作用：1.能识别双链DNA的某种特定核苷酸序列2.使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。④作用特点：具有特异性（专一性）。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子，⑤限制酶的识别序列：大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成作用结果形成两种末端：黏性末端或平末端1’2’3’4’5’脱氧核苷酸的结构G1’2’3’4’5’1’2’3’4’5’A3’,5-磷酸二酯键3’端5’端3’端5’端一个核苷酸核糖上第3位的羟基与下一个核苷酸核糖上第5位的磷酸羟基脱水缩合成酯键，该酯键称又3,5磷酸二酯键。磷酸二酯键：磷酸二酯键：即脱氧核糖、磷酸之间的连接仔细观察各限制酶识别的特定序列有何特点？限制酶的识别序列限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向重复的。黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割大肠杆菌的一种限制酶(EcoRⅠ)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。中轴线CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAG练习使用EcoRI剪切目的基因CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAG目的基因SmaⅠ平末端平末端只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。中轴线平末端平末端SmaI限制酶的切割当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。⑥限制酶的作用结果：产生黏性末端或平末端。你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？P4原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。课后习题：为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA?主要切割外源DNA，而对自身的DNA不起作用，达到保护自身的目的。原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。1.下列关于限制酶的说法正确的是A．限制酶广泛存在于各种生物中，但微生物中很少B．一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列C．不同的限制酶切割DNA后都会形成黏性末端D．限制酶的作用部位是特定的核苷酸形成的氢键B2.在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片断时，需使用A．同种限制酶B．两种限制酶C．同种DNA连接酶D．两种DNA连接酶A3.下列四条DNA片段，可能是由同一种限制酶切割而成的是A．①②B．②③C．③④D．②④DDNA连接酶连接酶的作用：将互补配对的两个黏性末端或平末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。基因进行了切割以后就有了切口，怎样才能将有切口的基因与其他基因缝合在一起呢？积极思考（二）DNA连接酶分子缝合针磷酸二酯键GAATTCCTTAAGGPAP把两条双链DNA片段之间的缝隙“缝合”起来。即将脱氧核糖和磷酸连接起来.要实现目的基因与载体的连接则在对其切割时应选用限制酶。1、作用：作用原理催化磷酸二酯键形成2、作用部位：3、分类E·coliDNA连接酶或T4DNA连接酶根据酶的来源不同，可以将这些酶分为两类：同一种DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。类型来源功能相同点差别E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)作用应用限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA连接酶与限制酶的比较(1)区别：(2)两者的关系可表示为：使特定部位的磷酸二酯键断裂用于提取目的基因和切割载体在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键用于目的基因和载体的连接两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来DNA连接酶的缝合作用可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能连接单链DNA！E·coliDNA连接酶或T4DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键由于氢键是分子间作用力，其断裂与重新形成均以限制酶和DNA连接酶无关。DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低DNA连接酶的缝合作用AATTGCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶的作用DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质化学本质不同点模板作用对象作用结果用途都能催化两个核苷酸之间形成磷酸二酯键都是蛋白质，但组成和性质不同不需要需要形成DNA的一条链基因工程DNA复制DNA连接酶与DNA聚合酶的比较在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键(用于基因工程操作)将单个核苷酸加到已存在的DNA片段的3′端的羟基上，形成磷酸二酯键(用于DNA的复制)将存在的DNA片段连接成完整重组DNA分子限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶Ⅱ的切点。（1）请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。（2）请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。（3）在DNA连接酶作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？为什么？—G↓GATCC——CCTAG↑G—用酶Ⅰ切割—GGATCC——CCTAGG——↓GATC—……—↓GATC——CTAG↑—……—CTAG↑—用酶Ⅱ切割目的基因—GATC—……—GATC——CTAG—……—CTAG—目的基因可以连接。因为由两种不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的（或是可以互补的）（三）基因进入受体细胞的载体分子运输车具备哪些条件才能充当“分子运输车”？A、具有多个限制酶切割位点，以便外源基因插入其中；B、具有特殊的标记基因，便于鉴定和选择。C、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；D、对受体细胞无害2、载体的作用1、载体必须具备的条件：3、种类：将外源基因送入受体细胞。质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒等E、载体DNA分子大小应适合,以便提取和在体外进行操作,太大就不便操作.在受体细胞内对目的基因进行大量复制有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。有切割位点能复制并带着插入的目的基因一起复制质粒——裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体（即拟核DNA）之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。最常用运载体——质粒实际上在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，并不具备所有条件，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。小结基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有专一性(识别序列)切开DNA分子的磷酸二酯键DNA连接酶连接磷酸二酯键种类E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶运载工具具备的条件结构简单,大小适中能在宿主细胞中自我复制并稳定存在具一个或多个限制酶切位点具标记基因对受体细胞无害质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒项目种类作用底物作用部位作用结果限制酶DNA连接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶DNA解旋酶几种酶的比较：DNA分子磷酸二酯键形成黏性末端或平末端DNA分子片段磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键DNA分子DNA分子脱氧核苷酸形成重组DNA分子形成子代DNA分子形成脱氧核苷酸形成单链DNA分子碱基对间的氢键(1)不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同；同一个DNA分子用不同限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。(2)不同限制酶切割形成的黏性末端，如果互补则可以相互重新配对。四种酶的作用部位图解(1)作用于a(磷酸二酯键)的酶有：(2)作用于b(氢键)的酶是:限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶。解旋酶。(1)DNA连接酶的作用不是连接互补的碱基之间的氢键，而是脱氧核糖和磷酸间的磷酸二酯键。(2)限制酶切割一次，会产生2个黏性末端或平末端，水解2个磷酸二酯键。(3)限制酶的作用并非只是切取目的基因，还用于切割载体。1.下列关于DNA连接酶的叙述中，正确的是①催化相同黏性末端的DNA片段之间的连接②催化不同黏性末端的DNA片段之间的连接③催化两个黏性末端互补碱基间氢键的形成④催化DNA分子两条链的脱氧核糖与磷酸之间的磷酸二酯键的形成A．①③B．②④C．②③D．①④D2.下列哪项不是基因工程中经常使用的“分子运输车”A．细菌质粒B．λ噬菌体的衍生物C．动植物病毒D．细菌核区的DNAD3.下列关于基因工程中所选用的质粒的说法，错误的是A．不能没有标记基因B．是小型链状的DNA分子C．能够自我复制D．可与目的基因重组B4.下图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是()A．①②③④B．①②④③C．①④