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第40章、重组DNA技术1.目的基因的获取2.克隆载体的选择与构建3.外源基因与载体的连接4.重组DNA导入受体菌5.重组体的筛选6.克隆基因的表达(一)目的基因的获取1.化学合成法2.基因组DNA3.cDNA4.聚合酶链反应基本概念•基因（gene）：P219•基因组（genome）：P292•基因组学（genomics）：研究基因组的结构、信息与功能的科学。•基因组计划：HGP——P440•后基因组•功能基因组基因文库•基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)•cDNA文库(cDNAlibrary)聚合酶链反应（PCR）•PolymeraseChainReaction•基本原理：变性、退火、延伸(二)克隆载体的选择和构建•质粒DNA••克隆载体噬菌体DNA•病毒DNA(三)外源基因与载体的连接连接策略1.粘端DNA间的连接(1)同一限制性内切酶切割位点连接(2)不同限制性内切酶切割位点连接2.平端DNA间的连接3.同聚物加尾连接4.人工接头连接(四)重组DNA分子导入受体菌•无性繁殖•感受态细胞:容易接受外源DNA的状态.•方式:转化、转染、感染导入大肠杆菌1.氯化钙转化法2.电击法3.体外包装感染法•导入哺乳动物细胞•1.显微注射法•2.电穿孔法•3.DNA-磷酸钙共沉淀•4.DEAE-葡聚糖转染法•5.病毒感染法•6.脂质体介导法•7.细胞融合法•8.原生质体融合法•9.微细胞介导法(五)重组体的筛选直接选择法1.抗药性选择2.标志补救3.分子杂交法间接筛选法核酸水平*1.酶切图谱*2.核酸探针*3.PCR*4.序列测定蛋白质水平免疫学的技术：SDS-PAGE、Westernblot、ELISA、放免、免疫沉淀、荧光抗体等抗药性筛选重组体(六)克隆基因的表达•原核表达体系——表达载体的标准：1.含有大肠杆菌适宜的选择标志2.具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子3.含有适当的翻译控制序列4.含有合理设计的多接头克隆位点真核表达体系关键步骤是将重组DNA导入真核细胞DNA克隆的基本过程1.分：分离目的基因2.切：对目的基因和载体适当切割3.接：目的基因与载体连接4.转：重组DNA转入受体菌5.筛：筛选出含有重组体的受菌体基因工程技术策略分：基因载体目的基因质粒噬菌体病毒直接分离cDNA人工合成基因文库切：限制性内切酶有缺口的载体目的基因接：连接酶粘端连接平端连接尾接法重组体转：转化转染体外包装带重组体的宿主筛：表型筛选电泳法核酸杂交基因工程技术与医学的关系1.生命科学研究的趋势2.疾病基因的发现3.发展生物制药4.基因诊断与基因治疗5.遗传病的预防基因工程的目的1.醫學用途:超過１００種基因治療法已經在全球推行2.改善農業:糧食產量大增，解決飢荒；抵抗病蟲害，耐寒耐旱，防止早熟和腐爛，保存期更長。3.稀有動物的保育:拯救瀕臨絕種的動物4.其他:政治用途、經濟用途、娛樂用途等。•转基因作物，目前最常见的是转入抗除草剂基因，这样的转基因作物可以抵抗普通的、较温和的除草剂，因此农民用这类除草剂就可以除去野草，而不必采用那些毒性较强、较有针对性的除草剂。•其次是转入抗虫害基因，用得最多的是从芽孢杆菌克隆出来的一种基因，有了这种基因的作物会制造一种毒性蛋白，对其他生物无毒，但能杀死某些特定的害虫，这样农民就可以减少喷洒杀虫剂。据统计，在过去的四年内，美国由于推广抗虫害转基因作物，少喷洒了270万磅的杀虫剂。转基因作物还能增加产品，例如抗虫害转基因玉米能增产5－15％。•转基因技术也可用于改变食物的营养成分，例如减少土豆的水分，这样炸出来的土豆片更脆；降低植物油中的不饱和脂肪酸，能延长储存期限。转基因西红柿不仅容易运输、保存，而且味道也更佳。菲律宾的国际水稻研究院正在试验“金水稻”，通过转基因技术让水稻制造贝塔胡萝卜素（维生素A的前体），有助于消灭在亚洲地区广泛存在的维生素A缺乏症。转基因技术也可提高水稻中铁元素的含量，以减少亚洲妇女常见的贫血症。•转基因作物的历史很短。1992年，中国种植了世界上第一批商用转基因作物－－转基因烟草。1994年，美国市场上才首次出现了转基因食品，一种软化缓慢的西红柿。由于转基因作物的巨大优势，推广非常快。到2000年，全世界已有4420万公顷的土地种植转基因作物，其中美国占68％，阿根廷占23％，加拿大占7％，中国占1％，其他国家占1％。大豆、玉米、棉花和油菜是主要的转基因作物，在美国，有近一半的大豆、棉花，超过三分之一的玉米、油菜是转基因作物。美国超级市场上的食物制品中，约60％含有转基因的成分。在公众的反对声中，目前这个发展势头已缓慢下来，特别是在工业化国家，转基因作物的种植面积有减少的趋向。美国虽然还没有限制转基因作物，但是由于美国是农产品出口大国，欧洲、日本对转基因作物进口的限制，也打击了美国农民的积极性。Transgenictobaccoplantwithgeneforfireflyluciferase关于基因工程的争议A.花那麼多經費研究基因工程，卻不能妥善照顧貧困的病人，不關心是否建立比較健全的公共衛生體系，來有效預防和治療疾病，或是訂定較完整的社會福利措施，這樣是否合乎倫理？B.掌握基因工程科技的強國是否藉著優勢來宰制弱小國家？基因工程技術落入犯罪集團或野心家手中怎麼辦？提高了糧食產量，是否造成另一個資源分配不均的問題？ArgumentsonHumanCloningA.人是否該擁有基因專利權？是否可以轉讓出賣？新的基因組合的專利是屬於科學家(醫生)的，還是那個複製人的？如何保護專利權？如果有人在街上砍你一刀，取得血液細胞來複製人，那怎麼辦？在醫院裡，外科醫生偷偷用你的細胞複製人怎麼辦？ArgumentsonHumanCloningEthicalConsiderationsＡ.複製人的養育責任是誰？複製人長大以後是否告知其出身？Ｂ.誰是他的父母？被複製人與被複製人的配偶？被複製人的父母？科學家(醫生)？代理孕母？Ｃ.複製人推翻家庭婚姻制度，使得生育不再是家庭婚姻內的產物，他可能沒有自己的家庭。Ｄ.社會應該如何看待複製人？如何免受歧視？人權、社會地位、法律身分如何定義？生命价值问题Ａ.一個人有權決定另一個人的基因嗎？有權決定另一個人的生命嗎？Ｂ.複製人因為科學家(醫生)的疏忽造成的生理缺陷，導致心理不平衡的問題。Ｃ.社會一定偏好複製傑出或特殊人士(如愛因斯坦或希特勒)，所以複製人處處被別人拿來和被複製者比較，可能他沒有被複製者有極高的成就而感到挫折。複製人沒有自由選擇自己前途，活在被複製者的陰影，被物化，市場化。他選擇人生的方向、興趣、生活被剝奪，因為社會要求麥克喬丹的複製人打籃球，可是他喜歡踢足球。他會羨慕別人沒有這些問題，並且怨恨自己的命運、怨恨科學家(醫生)、怨恨被複製者...Ｄ.製造出一堆體育高手，那麼運動會有何意義？製造出一堆品種優良的人類，那麼由自然生育的，而且品種較差的人、殘障的人，他們的生命有何意義？複製人顛覆了社會對人的價值的觀念，對人成功有新的解釋:那是因為他品種好啊！醫療倫理、道德責任與科學研究問題Ａ.複製自己來取得器官合乎道德嗎？這是不道德的，現行法律會以傷害罪來起訴。因為複製人不是他的備份，任他宰割的。退一步來問，用基因工程故意造出腦死的、無頭的、早死的複製人來移植器官合乎道德嗎？Ｂ.用基因重組產生一種類似人類的動物來移植器官，或是把動物注射人類基因，那麼這個「動物」要含有多少人類基因才能擁有人權呢？90%的人類基因嗎？80%呢？50%呢？Ｃ.造出四肢發達、頭腦簡單的人，來供人使役的不道德作法。Ｄ.診斷錯誤的責任承擔、複製人有缺陷的責任問題。Ｅ.代理孕母的道德問題。她是否淪為「孵卵機器」，把子宮出租十個月？•问：试管婴儿刚出来的时候不为世人所容，但后来也渐渐被接受了，克隆人在将来会不会也被人们接受呢？•兰德：试管婴儿和克隆人有本质区别，试管婴儿说到底还是精子和卵子的结合，是一种自然的生育方式。我看不出克隆人有何必要和好处。我很高兴地看到，美国已经出台了禁止克隆人的法律。我还想说说细胞治疗和干细胞研究。我绝对支持这种技术，它不是克隆人，而是克隆细胞，比如克隆出一个可以发育成胰腺的细胞来治疗糖尿病。有人用克隆性治疗来描述细胞治疗，我认为克隆性治疗这个词非常不好，容易和克隆人产生混淆。不幸的是，包括美国国会一些议员在内的很多人就闹不清楚细胞治疗和克隆人的区别。•２００１年２月１５日英国《自然》杂志关于人类基因组草图论文的第一作者•问：世界上所有生物的基因一旦全部被破解，会不会一切都像玩拼图一样？•柯林斯：这是一个很严肃的问题，但它的答案也非常简单，那就是“不”。我们现在就像一个无知的孩子，刚刚走进一个硕大的图书馆，图书馆中摆着许许多多生命的天书，它们是自然花了几十亿年时间写就的。我们现在知道的不过是其中一点点，千万不要自以为是。我们阅读这些生命天书的时候，应当对上帝的创造深深地感恩，而不是去扮演上帝的角色。•美国国家人类基因组研究所所长、美国科学院院士本章内容小结•概念：•接合、转化、转导、转染、转座•重组DNA技术、载体、质粒、基因组DNA、cDNA等•自然界基因重组的几种方式•重组DNA技术的基本原理，用五个字概括•目的基因获取的几种方式•外源基因与载体连接的几种方式