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重组DNA表达系统天津科技大学生物工程学院罗学刚体外表达：无细胞表达系统原核表达系统：大肠杆菌表达系统等体内表达：酵母表达系统真核表达系统昆虫细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统动物/植物表达系统（转基因动物/植物）体系选择研究基因功能:大肠杆菌,裂殖酵母,昆虫细胞,CHO细胞多肽药物生产:大肠杆菌,毕氏酵母,CHO细胞,乳腺组织疫苗:大肠杆菌,酵母,大多数沿用细胞培养产物进行灭毒单抗生产:杂交瘤细胞工业酶生产:各种微生物一、体外表达系统（无细胞表达系统）体外翻译系统又称无细胞蛋白质合成系统，是一种相对胞内表达系统而言的开放型表达系统。优点：内源型mRNA干扰很小，操作程序简单，获得重组蛋白周期很短。主要用于蛋白质快速分析鉴定；基因转录和翻译调控机理研究；分子间的相互作用的研究。缺点：昂贵；操作要求高；表达量不够高。主要的体外表达系统：1、兔网织红细胞系统，由新西兰大白兔制备。2、麦胚提取物系统，可稳定地表达一些在兔网织红细胞中翻译受到抑制的DNA。3、原核体外翻译系统（S30原核体外翻译系统），E.coliS30提取物由OmpT内切酶和Lon蛋白酶缺陷的E.coliB菌株制备，所以在S30系统中表达基因可以增加产物的稳定性。目前多家公司有商业化产品，常见的有：RTSE.Coli系统;RTS100wheatgermCECF系统(Roche)TNT®快速偶联转录/翻译系统(Promega)；GoldTNT®T7Express96系统（Promega），该系统有SP6和T7两种类型，适合在96孔板上进行大规模高通量筛选分析；TNT®T7QuickforPCRDNA(promega)，PCRDNA的TNT®T7快速系统从PCR反应液中直接取样，无需纯化DNA，直接用于偶联的转录/翻译反应；TNT®偶联小麦胚芽抽提系统(promega)。二、原核表达系统特点：产量高、生长速度快、操作容易、成本低。缺点：翻译后加工修饰体系不完善：无糖基化、酰基化等一般表达获得的蛋白常常以变性状态存在，不具有生物学活性。（一）大肠杆菌表达系统目前较常用的表达载体是具有可诱导的T7启动子的表达载体，大部分蛋白均可获得表达而且表达量较高，表达量可占细菌总蛋白的25％以上。T7RNA聚合酶来源于T7噬菌体，期活性高于大肠杆菌RNA聚合酶很多倍，而且较少发生转录中止它只识别自己的启动序列，不能启动大肠杆菌DNA的转录，对抑制大肠杆菌RNA聚合酶的抗生素如利福平有抗性，因而可在利福平存在的条件下，使目的基因得到大量扩增正常大肠杆菌并不表达T7RNA聚合酶，为了能利用T7启动子表达外源基因，将T7RNA聚合酶基因置于lacUV5启动子控制下，整合到大肠杆菌染色体，构建了能被IPTG诱导表达T7RNA聚合酶的大肠杆菌菌株常用宿主细胞有BL21（DE3）、JM109（DE3）等还有受温度变化诱导的具有λ噬菌体PL启动子调控的载体等。按蛋白质类型分•单纯表达:pJLA系列,用NcoI/NdeI导入AUG的载体•融合表达:融合各种tag,GST,CBD,MAL,GFP,etc分泌表达:pel/ompT分泌肽按启动子分•lac及衍生的tac,trc,pac,rac等启动子IPTG诱导•lamdaphagePL和PR启动子热诱导•T7启动子IPTG诱导•T5启动子IPTG诱导•ara启动子阿拉伯糖诱导大肠杆菌表达载体分类常见的大肠杆菌商业化表达系统有：1、pETsystemandpETBlue™system（Novagen公司），是原核蛋白表达中应用最多的系统。具有可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌。目前共有包括40多种载体、15种不同宿主菌和配套齐全的用于有效检测和纯化目标蛋白的相关产品。基本结构由T7启动子、核糖体结合位点、信号肽序列、多克隆位点、T7转录终止信号、氨苄青霉素抗性基因核质粒复制位点等有可以表达N端融合、C端融合和非融合蛋白的不同质粒。也可以表达非分泌性蛋白2、pBAD表达系统（Invitrogen公司），可控制蛋白质的生产水平低于其成为不溶性蛋白的域值。通过与硫氧还蛋白的融合来增加溶解度3、QIAexpressExpressionSystem（Qiagen公司）。•pJLA50X系列;pcDNAII;etc•pET系列(T7promoter,Novagen公司)•pQE系列(T5promoter,Qiagen公司)•pMAL系列(周质表达,BioLabs公司)•pGEX系列(GST融合表达,Pharmacia公司)•pBAD系列(Arabinose诱导型)常用表达载体•pTYB系列(CBD融合,可以自我切割,BioLabs)•BL21(DE3)/pLysS:自身表达T7RNApolymerase适用pET系列等带T7启动子的载体•M15/SG13009:自身表达T5RNApolymerase适用pQE系列等带T5启动子的载体•BL21TrxB(DE3):thioredoxinreductase突变•Origami:thioredoxinreductase/glutathionereductase双突变适合带thioredoxinreductase的融合表达载体,帮助形成更多的二硫键•BR21CodonPlusRIL:富含AT的真核生物基因的表达•BR21CodonPlusRP:富含GC的真核生物基因的表达特殊的表达用菌株外源基因在原核细胞中的表达形式按表达蛋白的部位分：分泌表达；外周质及膜上表达；胞内表达。外源基因在原核细胞中的表达形式在原核细胞中表达外源基因时，可产生融合型、非融合型。原则上应能够使外源基因表达效率高，蛋白质产量高，不易被细菌分解，而且产物易被提取、纯化。融合基因的表达外源基因在大肠杆菌中表达的一种简便方法是使其表达为融合蛋白，也就是说要表达的外源基因连接在一段原核基因的下游，蛋白质的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列编码，C端由外源DNA的完整序列编码，这样的蛋白质由1条短的原核多肽或具有其他功能的多肽和外源蛋白质结合在一起，故称为融合蛋白。融合蛋白的特点①转录和翻译起始从正常的大肠杆菌序列开始，故通常可以产生高水平的融合蛋白；②融合蛋白往往比天然的外源蛋白更加稳定；③产生的融合蛋白较大，容易从蛋白质凝胶电泳中区别出夹，而且融合蛋白带可以从凝胶上切下，经冷冻于燥，磨成粉末后即可作为抗原；④有些融合蛋白带有信号肽，可以分泌到细胞外。这有助于蛋白质的分离和纯化。融合方式6×HisTag融合半乳糖苷酶融合trpE融合蛋白谷胱甘肽S－转移酶（GST）融合硫氧还蛋白（Trx）融合麦芽糖结合蛋白（MBP）融合碱性磷酸酶（phoA）启动子和信号序列•ProteinA•GST（glutathioneS-transferase）•CBD(chitin-bindingdomain,BioLabs;cellulose-bindingdomain,Novagen)calmodulin-bindingdomain,Stratagene)•MBP(maltose-bindingprotein)•GFP(greenfluorescenceprotein)•Thioredoxin**帮助二硫键形成•Dsb(periplasmaenzymeDsbA,DsbC)**二硫键的形成与•SUMO(smallubiquitin-relatedmodifier)•KSI(ketosteroidisomerase)基本上全部沉淀各种融合蛋白表达载体帮助可溶化帮助分泌到周质可用亲和层析纯化•His-tag(6-8Histidine)•T7-tag(MASMTGGQQMG)•HSV-tag(QPELAPEDPED)•S-tag(KETAAKFERQHMDS)•VSV-G-tag(TTDIEMNRLGK)•HA-tag(YPYDVPDYA)•Flag-tag(DYKDDDDK)•Myc-tag(EQKLISEEDL)各种用于抗体识别的标记•如果所表达的蛋白质有二硫键并需要正确的立体结构,尽可能进行可溶性表达;•如果所表达的蛋白质没有二硫键或只用来制备抗血清,采用包含体表达比较好;•如果希望表达的多肽的分子量小于10kDa,一定要进行融合表达•采用MBD融合•采用GST融合•采用CBD融合•采用thioredoxin融合•采用Origami等宿主菌•降低菌体培养的速度温度(15-30℃),降低转速让表达产物可溶化•采用CBD融合(pET36/37)•采用Dsb融合(pET39/40)•采用带pelB/ompT引导肽的载体(pET12/20/22)•采用带MBD融合(pMAL载体,Biolabs)•采用带SUMO融合(pETSUMO,Invitrogen)让蛋白质分泌到间质去融合表达的蛋白，在分离纯化过程中往往需要去除表达时额外引入的融合片段。因此需要用不同方法将其裂解，通常有：1、化学裂解法：特异识别特定的氨基酸残基或一组氨基酸残基。但化学裂解法裂解位点的特异性低，有时可能对目标蛋白产生不必要修饰如：甲酸、溴化氰等2、酶解法：反应条件温和，具有高度的特异性。常用的酶有Xa因子、凝血酶、肠激酶、凝乳酶、胶原酶等。但酶解法成本高，反应时间长，更重要的是蛋白酶本身不可避免地混入目标蛋白中，造成新的污染，提高纯化的复杂性。•DTT:intein的↓Cys•溴化氰:Met↓•Thrombin:LVPR↓GS•FactorXa:IEGR↓•Enterokinase:DDDDK↓•PreScissionTMprotease:LEVLFQ↓GP•GenenaseITMPGAAHY↓•TEVprotease:ENLYFQ↓G融合蛋白的专一性切割3、IMPACT系统(inteinmediatedpurificationwithanaffinitychitin-bindingTag)该系统是由枯草杆菌来源的几丁质结合域（5kD，chitinbindingdomain，用于亲和纯化）和酵母蛋白质剪接元件intein组成一个双效的融合标签。intein在较低的温度和还原条件下发生自身介导的N端裂解，释放出与之相连的目的蛋白。因此融合蛋白无需蛋白酶裂解即可实现目的蛋白与fusiontag的精确切割。但含有较多二硫键的蛋白不适合这一系统。分泌型表达为减少所需蛋白质在宿主体内被蛋白酶降解。或者使蛋白质能够在体外正确折叠和便于提纯，经常需要将被表达的蛋白质分泌到细胞外，因此要用分泌型载体。分泌型载体的优点①一些在胞内被蛋白酶降解的蛋白质在细胞周质中很稳定；②一些在胞内无活性的蛋白质在分泌后便具有活性，分泌可能使蛋白质能够正确折叠；③产生的蛋白质没有氨基末端甲硫氨酸，因为切割位点在信号肽与编码序列之间，甲硫氨酸会影响许多蛋白质的活性。蛋白质能够在大肠杆菌中进行分泌，至少要具备3个要素：①有一段信号肽；②在成熟蛋白质内有适当的与分泌相关的氨基酸序列；③细胞内有相应的转运机制。信号肽长度一般为15—30个氨基酸残基真核生物和原核生物的信号肽在结构上都有以下特征：①信号肽一般都不长，在氨基末端有一段带正电荷的氨基酸序列，往往是精氨酸或赖氨酸残基，其数目为1—3个；②有一个高度疏水的核心区，含亮氨酸或异亮氨酸残基，位置可以从带正电荷的氨基酸延伸到含切割位点的区域；③含有能被信号肽酶水解的切割位点，这个位点常常在丙氨酸之后，有的是在甘氨酸或丝氨酸之后分泌型载体也有缺点，例如目的蛋白质的产量往往很低，以及信号肽不能被切除或切在错误位置上等。非融合蛋白的表达指在细菌内表达的蛋白质以真核蛋白质mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含任何细菌多肽序列。优点：表达产物的生物学功能接近于生物体内天然蛋白质。缺点：容易被细菌蛋白酶破坏。包含体（包涵体）表达的蛋白质经常是不溶的，会在细菌内与细菌杂蛋白、核酸等成分形成不溶性聚合体即包含体（inclusionbody），尤其当表达目的蛋白量超过细菌体总蛋白量10%时，就很容易形成包涵体生成包涵体的原因可能有是