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第2章胚胎发育的准备•生殖细胞的决定和迁移精子发生卵子发生动物的生殖方式•在很早期的发育阶段，昆虫、脊椎动物和其它许多动物的生殖细胞和体细胞就有明显的分化，也有不少动物体细胞与生殖细胞的分化并不确定，在一定的条件下细胞能够转化成为生殖细胞，如腔肠动物、扁虫和被囊动物等。另外，许多无脊椎动物的孢子（zooid），息肉（polyp）和芽（bad）的体细胞也具备产生新个体的能力。第一节生殖细胞的决定和迁移•在胚胎发育初期生殖细胞就已决定的动物，其生殖细胞来源于它的前体——生殖干细胞（germstemcell,GSC）。这些生殖干细胞只有经过迁移，进入发育中的生殖腺原基（genitalanlage）——生殖脊）（genitalridge）才能分化成为生殖细胞。•生殖质是具有一定形态结构的特殊细胞质，主要由蛋白质和RNA构成。这些具有生殖质的细胞将分化成为原生殖细胞。1.1生殖质与生殖细胞迁移线虫：P颗粒对最初细胞分化的影响•果蝇：原生殖细胞呈现在受精卵的后极，它们被称为极细•胞，含极粒（polegranules）爪蟾：其生殖质是位于植物极附近富含RNA和蛋白质的一团特殊细胞质。爬行类和鸟类:GSC来源于外胚层细胞，然后经过明区的中部，移到明区前缘与暗区交界处----生殖新月.哺乳动物：在7天的小鼠胚胎中，约8个PGC位于原条后部的胚外中胚层中.(1)线虫(2)果蝇的原生殖细胞的命运决定于后部极质果蝇P颗粒由蛋白质和RNA成分组成。•（1）germcell-less（gcl）基因的mRNA和蛋白，它是受精前后卵泡滋养细胞（nursecell）的基因转录产物，经过滋养细胞与卵细胞之间的通道转运到卵细胞质之中，gclmRNA进入卵细胞以后迁移定位在未来发生生殖干细胞的部位并开始翻译产生蛋白质•（2）nanosmRNA，这是一个影响果蝇腹部分化发育的基因，•（3）线粒体大核糖体RNA(游离于线粒体之外)，用紫外线照射极细胞破坏其中的RNA成分，之后注射给予线粒体大核糖RNA，可以恢复极细胞的发生。•（4）polargranulecomponent(Pgc)的非翻译RNA分子，对于它的功能目前还不清楚，但是反义RNA可以造成极细胞不向生殖腺迁移。•（5）其他7种基因(cappuccino,spire,staufen,oskar,vasa,valois,tudor)，它们在滤泡细胞中被激活，产物进入发育卵细胞之中，这些基因的突变将干扰P颗粒成分的正确定位。果蝇原生殖细胞的迁移生殖腺前体细胞两栖动物的种质质定位在卵的营养极，用紫外线照射胚胎营养极之后，生殖腺中将缺少生殖细胞。其定位依赖于微管，其迁移与kenesin-likeprotein有关。迁移路线：营养极－囊胚腔内胚层表面－形成PGC－幼虫肠后部聚集－沿肠背部迁移至中肠上部的生殖嵴中，每个生殖嵴有～30PGC。(3)两栖动物生殖细胞命运也决定于种质质(4).鸟类和爬行类生殖细胞迁移•GSC来源于外胚层细胞，然后经过明区的中部，移到明区前缘与暗区交界处，这个区域称为生殖新月（germinalerescent），GSC在生殖新月区内增殖，然后借助血液循环进行迁移，最终到达生殖腺。(5)哺乳动物生殖细胞迁移其生殖细胞没有特殊形态特征，其发生涉及细胞间的相互作用。免疫组织化学方法显示，小鼠PGCS最初来源于原肠作用中胚胎的外层，于胚胎发育第7天，在原条后部的胚外中胚层有8个PGCS，这些细胞体积较大，碱性磷酸酶染色呈阳性反应。它们先在尿囊与后肠交接处附近聚集，以后迁移到卵黄囊附近再分成两群，最终进入左、右两侧生殖嵴。在原肠胚期，小鼠的PGC位于上胚层中。在7天的小鼠胚胎中，约8个PGC位于原条后部的胚外中胚层中，其后它们迁移经过内胚层、尿囊、卵黄囊到达后肠，再沿后肠背壁向前迁移到达生殖嵴，此时的PGC达2500~5000个。干细胞生长因子(SCF)是防止PGC凋亡所必需的，也能促进其繁殖。它由PGC迁移路径中的细胞合成，定位在膜上。White突变(缺失SCF受体基因)或Steel-Dickie突变(SCF不能定位在膜上)的小鼠无PGC或很少的PGC.5、哺乳动物生殖细胞1.2生殖细胞定向分化的决定对于大多数动物，迁移进生殖腺原基的原生殖细胞具备两种发育潜能，由生殖腺所在的微环境决定分化成精子或卵子。这里涉及两种决定：第一种决定是生殖干细胞是进入减数分裂进行配子发生，还是继续进行有些分裂成为生殖干细胞；第二种决定是进行减数分裂的细胞是发育成卵子还是精子。如秀丽新小杆线虫的远端细胞：它们可能分泌一些物质能够维持细胞进行有些分裂，且抑制减数分裂的进行。野生型的秀丽小杆线虫的生殖细胞既能形成卵子也能形成精子。图1.7P16第二节精子发生1精子产生（spermatogenesis）原始生殖细胞在睾丸的精细管中成为精原细胞A1，精原细胞分裂成另一个精原细胞A1和一个着色较浅的精原细胞A2。因此，精原细胞A1是能够分裂复制自身并产生另一类细胞的生殖干细胞。在整个发育过程中，原始生殖细胞的后代通过细胞质桥相互联系，分化完全的精子才相互分开，因为每群细胞可同步成熟。图1.9由于精原细胞A1是生殖干细胞，所以精子的发生能够持续进行。2.1精子形成•一个典型的动物精子，在它的头部下有顶体囊，或称为顶体（acrosome）；在其后部依次为高度浓缩的细胞核，在颈部的一对中心粒，中段中含大量能量供给站的线粒体和最末的有推进作用的鞭毛。这时的精子已具备了运动和受精的能力。精子分化(spermiogenesis):高尔基体形成顶体泡，中心粒产生精子鞭毛，线粒体整合入鞭毛，核浓缩，胞质废弃，最后产生成熟的精子。2.2精子发生中基因表达的调控精子发生过程基因转录主要发生在减数分裂的双线期。最好的例子是果蝇Y染色体的转录活动。果蝇的Y染色体上有5个向外伸出的DNA环构成的灯刷状结构。在精子发生过程中被特异性转录的基因产物，通常是精子运动和精子与卵子结合时都必需的蛋白质。如B2一微管蛋白：对于减数分裂纺垂体利用丙酮酸作为能源。鱼精蛋白（protamine）：在精子发生过程中，由于组蛋白被鱼精蛋白或某些被修饰的组蛋白所取代，使单倍体的基因组处于凝集状态，因此，在随后的发育阶段，基本检测不能雄性基因组的转录活动。第三节卵子发生3.1卵母细胞的减数分裂通过精子发生形成的配子，实质上是一个“能运动的细胞核”，而由卵母细胞形成的配子却含有启动发育和维持代谢所需要的全部元件。因此，卵子发生的过程除了形成单倍体的细胞核之外，还要建立一个由酶、mRNA、细胞器(中心体除外)、营养物质以及发育信息所组成的细胞质库，具备十分复杂的细胞质体系。其次，卵母细胞有一个很长的减数分裂前期，使卵母细胞充分生长。与精母细胞减数分裂相比，卵母细胞减数分裂的另一个特征中两次成熟分裂都并非是均等分裂。不同物种的产卵力差异很大，如海胆和两栖动物的卵原细胞可以终身进行有丝分裂，每次可产卵成百上千个。哺乳动物的生殖细胞在出生后就不具备有丝分裂能力。妇女一生只能排出约400个成熟的卵。卵子的发生(oogenesis)3.2初级卵母细胞的分裂是不均等的初级卵母细胞分裂产生一个含有所有细胞质的次极卵母细胞和几乎不含胞质的第一极体。减数分裂的例外•在少数物种里甚至存在这样的现象，减数分裂被强烈地修改了，使产生的卵细胞的染色体仍然是两倍的，即它不需受精便可发育出新的个体。•第四节动物的生殖方式动物的生殖有3种形式，即有性生殖、孤雌生殖和无性生殖。有性生殖和孤雌生殖是以生殖细胞发育成新个体，无性生殖则以二倍体细胞获得后代。哺乳动物在系统发育中形成了有性生殖的模式，但人们可通过细胞的体外操作，胚胎分割和细胞核移植获得无性生殖的哺乳动物。例如：通过体细胞核移植出生了著名的多莉绵羊；对原核胚进行原核交换移植，构成仅含雄性基因组的胚胎(雄核胚)或仅含雌性基因组的胚胎(雌核胚)；从而研究和阐明了父源和母源基因在个体发育中的作用。又如采用极体核移植，已发现第一和第二极体具有发育的全能性。精子发生过程中，二倍体的精母细胞经过两次减数分裂形成4个圆形含等量胞质的精子细胞，并将发育成4个正常的精子。而卵子发生则不同，通过减数分裂只保留一个能参与胚胎发育的大卵母细胞，另外分裂出两个含细胞质很少，体积很小，不参与胚胎发育的极体。1997和1998Fang和Wakayama等的研究结果证实，将PbⅠ注入去核卵母细胞后注入精子头部或将PbⅡ注入去除雌原核的受精卵均可产生具有生殖能力的小鼠后代。因此，从理论上讲用一个卵母细胞的染色体可能繁殖出4个子代。哺乳动物第一和第二极体的研究PbⅠ的发育选择含有活PbⅠ的卵母细胞，对其透明带作一小孔，注射管通过小孔插入卵周隙，吸取PbⅠ的全部内容物，并立即注入去核的受体卵母细胞，培养2h后将单个精子头部注入其中。注入精子激活后排出PbⅡ和形成雌、雄两原核。结果：171枚注入PbⅠ的卵母细胞作体外培养，92枚(53.8%)存活。注入精子后79枚(85.9%)完成受精过程，其中74枚卵裂成2-细胞期胚胎。将其移植至11只假孕母鼠受体，生产37只仔鼠。饲养27只仔鼠性成熟后互相交配，15只雌鼠妊娠并获正常的窝产仔数。PbⅡ的发育将PbⅡ注入去除雌原核的原核胚卵周隙中，经电融合构成重组胚。另一方法是将PbⅡ与仅含雄原核的原核胚置于含25%植物血球凝集素的M2液中凝聚，继而进行电融合构成重组胚。PbⅡ的重组胚均有发育良好的雄原核和1较小的雌原核(由PbⅡ形成)。体外培养大部分可卵裂为2-细胞期胚胎。23枚PbⅡ重组胚发育成的囊胚移入同期发情受体雌鼠，产下4只仔鼠，鉴定为PbⅡ遗传的后代。另一实验，将30枚PbⅡ重组胚的桑椹胚或囊胚，移入6只假孕雌鼠，全部妊娠，产下18只仔鼠，其中4只死亡其余14正常生长并具有正常的生育力。应用前景PbⅠ和PbⅡ是有正常生理功能的细胞。哺乳动物出生时因种的不同，卵巢中约有6~10万个卵母细胞，而在其一生的生殖周期中仅有数百个卵子成熟排出，99%以上的卵母细胞未起作用而退化。一个卵母细胞经过减数分裂产生4个单倍体细胞，其中3/4退化未起作用。因此，人们将建立各种哺乳动物一个卵母细胞产生4个后代的新技术。由此可见此项新发现的应用前景是不言而喻的。精子的头部含细胞质很少主要是一个核，极易冷冻长期保存。极体同样含胞质很少，主要是个细胞核，因此也将易于冷冻长期保存。此项新发现为哺乳动物(特别是珍稀动物)的种质保存开辟了新途径等。此项刚起步正待发展的新理论和新技术，应投入人力物力加以研究，使其早日产生经济与社会效益，为人类服务。雌核胚的发育将小鼠受精卵的雄原核移除，移入1个雌原核，组成具有两个雌原核的雌核胚(Gynogeneticembryo)。雌核胚体外培养，88%发育为桑椹胚和囊胚时期。移植至受体后，其发育程度与孤雌胚相似，而且总是极少滋养层。雌核胚和孤雌胚均因没有雄性基因组不能发育至出生，其主要原因是由于缺乏胎盘组织所致。因为至妊娠中期小鼠胎儿的生长依赖于通过胎盘获得营养，不能得到充分的营养胎儿停止发育而死亡。雄核胚的发育将受精卵的雌原核移除，移入另1雄原核组成具有两个雄原核的雄核胚(Androgeneticembryo)。经培养仅20%雄核胚发育至囊胚期。缺少X染色体时形成YY遗传结构的雄核胚，仅能卵裂数次即停止发育。雄性基因组不能有效地促进胚胎发育至囊胚期。很少雄核胚能着床发育，极少数着床后发育至6~8体节期，但具有发育良好的滋养层组织。以孤雌胚和雄核胚细胞聚合而成的嵌合胎儿检测两类细胞的分布结果：雄核胚细胞仅位于卵黄囊和滋养层，孤雌胚细胞则在胚体和卵黄囊，滋养层中无孤雌胚细胞。•上述研究结果表明，雌性基因组主要形成胚体，而雄性基因组主要形成胚外膜。其它生殖细胞类型有些动物种群卵子发生中减数分裂发生明显的变异，以至于产生二倍体的配子，不需要受精就能够发育，这种繁殖方式称为孤雌生殖（parthenogenetic）：如果蝇、蚱蜢等。•昆虫卵的发育1.果蝇卵的发育卵原细胞→4次有丝分裂→16细胞的合胞体（fusomes）→其中一个为卵母细胞（occyt