重组DNA技术基础1

与基因工程学科建立相关的1、4个里程碑事件：2、3大技术发现/发明：第二章重组ＤＮＡ技术基础DNA组成与结构一级结构碱基的排列顺序二级结构DNA的双螺旋形式高级结构DNA的超螺旋形式核酸分子组成DNA的分子结构（一）核酸的分类90%以上分布于细胞核，其余分布于核外如线粒体，叶绿体，质粒等。分布于胞核、胞液。(deoxyribonucleicacid,DNA)(ribonucleicacid,RNA)脱氧核糖核酸核糖核酸携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型(genotype)。参与细胞内DNA遗传信息的表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体。１.戊糖（构成RNA）1´2´3´4´5´OHOCH2OHOHOH-D-呋喃核糖(ribose)（构成DNA）OHOCH2OHOH-D-2-脱氧呋喃核糖(deoxyribose)2.碱基嘌呤(purine)嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶(cytosine,C)尿嘧啶(uracil,U)胸腺嘧啶(thymine,T)腺嘌呤(adenine,A)鸟嘌呤(guanine,G)核苷：AR,GR,UR,CR脱氧核苷：dAR,dGR,dTR,dCR3.核苷(ribonucleoside)碱基——核糖（脱氧核糖）连接方式：C——N糖苷键碱基（9/1位）——戊糖（1，位）OHOCH2OHOHNNNH2O1´1POOOHOHOCH2OHOHNNNH2O核苷酸：AMP,GMP,UMP,CMP脱氧核苷酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP４.核苷酸(ribonucleotide)核苷（脱氧核苷）——磷酸磷酸酯键5´端3´端５.核苷酸的连接３，－５，磷酸二酯键CGA二、核酸的一级结构定义：核酸中核苷酸的排列顺序（碱基序列）。5′端3′端CGAAGP5PTPGPCPTPOH3书写方法5pApCpTpGpCpT-OH35ACTGCT3竖式横式简化式DNA的空间结构一、DNA的二级结构（一）双螺旋结构DNA双螺旋结构模型要点（Watson,Crick,1953）两条DNA单链分子反向平行环绕，右手螺旋走向，表面大沟与小沟相间。螺旋直径为2nm，主链：戊糖－磷酸骨架位于外侧侧链：碱基对位于内侧碱基平面垂直于螺旋轴碱基距：0.34nm；螺距：3.4nm；周长：10对碱基。碱基形成氢键配对，配对形式为：A=T;GC）。碱基互补配对TACG稳定因素：1.氢键维持横向稳定性，2.碱基堆积力维持纵向稳定性。3.介质中阳离子可以有效地屏蔽磷酸基之间的静电斥力（二）与DNA碱基顺序相关的特殊结构碱基顺序颠倒重复而具有2倍对称的DNA段落镜像重复序列•tsDNA是在DNA双螺旋结构的基础上形成的，三条链均为同型嘌呤（homopurine，Hpu）或同型嘧啶（homopyrimidine，Hpy），即整段的碱基均为嘌呤或嘧啶。（三）三股螺旋DNA（tsDNA,也称H-DNA）Py-Pu-Py型，在偏酸性pH中稳定，较多见(四)酶活性DNA•1995年Cuenoud等发现了具有酶活性的DNA，再次丰富了酶学。•Cuenoud根据共有序列设计并合成了由47个核苷酸组成的单链DNA-E47，以此连接两个底物DNA——S1和S2二、DNA的超螺旋结构及其在染色质中的组装（一）DNA的超螺旋结构超螺旋结构(superhelix或supercoil)DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。正超螺旋(positivesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方同相同负超螺旋(negativesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反意义DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于DNA复制和RNA转录过程具有关键作用。（二）原核生物DNA的高级结构（三）DNA在真核生物细胞核内的组装真核生物染色体由DNA和蛋白质构成，其基本单位是核小体(nucleosome)。DNA：约200bp组蛋白：H1,H2A,H2B,H3,H4核小体的化学组成RNA的结构StructureofRNARNA的种类、分布、功能核蛋白体RNA信使RNA转运RNA核内不均一RNA核内小RNA胞浆小RNA细胞核和胞液线粒体功能rRNAmRNAmtrRNAtRNAmtmRNAmttRNAHnRNASnRNASnoRNAscRNA/7SL-RNA核蛋白体组分蛋白质合成模板转运氨基酸成熟mRNA的前体参与hnRNA的剪接、转运rRNA的加工、修饰蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组分核仁小RNA核蛋白体RNA信使RNA转运RNA核内不均一RNA核内小RNA胞浆小RNA细胞核和胞液线粒体功能rRNAmRNAmtrRNAtRNAmtmRNAmttRNAHnRNASnRNASnoRNAscRNA/7SL-RNA核蛋白体组分蛋白质合成模板转运氨基酸成熟mRNA的前体参与hnRNA的剪接、转运rRNA的加工、修饰蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组分核仁小RNAmRNArRNAtRNA一、mRNA的结构与功能hnRNA内含子(intron)mRNA外显子(exon)*真核细胞mRNA结构特点1.5´末端有甲基化鸟苷帽子结构：m7GpppNm-2.3´末端有多聚腺苷酸尾巴：PolyA。帽子结构促进mRNA由胞核向胞质的转位维持mRNA的稳定性翻译起始的调控帽子结构和多聚A尾的功能*mRNA的功能把DNA的碱基序列翻译成蛋白质的氨基酸顺序。DNAmRNA蛋白转录翻译原核细胞细胞质细胞核DNA内含子外显子转录转录后剪接转运mRNAhnRNA翻译蛋白真核细胞*tRNA的一级结构特点含10~20%稀有碱基，如DHU3´末端为—CCA-OH5´末端大多数为G具有TC二、转运RNA的结构与功能*tRNA的二级结构——三叶草形氨基酸臂DHU环反密码环额外环TΨC环氨基酸臂额外环*tRNA的三级结构——倒L形*tRNA的功能活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。*rRNA的结构三、rRNA的结构与功能*rRNA的功能参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。•rRNA的种类真核生物5SrRNA28SrRNA5.8SrRNA18SrRNA原核生物5SrRNA23SrRNA16SrRNAS（沉降系数）：单位时间内的沉降速度核酸的理化性质ThePhysicalandChemicalCharactersofNucleicAcid1.核酸的溶解度核酸是极性分子，微溶于水，不溶于乙醇或异丙醇。DNA+蛋白质→脱氧核糖核蛋白（DNP）：在1mol/L的NaCl溶液中的溶解度最大。RNA+蛋白质→核糖核蛋白（RNP）：在0.14mol/L的NaCl溶液中的溶解度最大。一、核酸的一般理化性质核酸属于两性电解质，但因为磷酸的酸性较强，因此总体呈现较强的酸性。具有较低的等电点。当溶液的pH4时，呈多负离子状态，容易与金属离子结合形成盐。2.酸碱性3.核酸的高分子性质粘度：DNARNAdsDNAssDNA4.核酸的紫外吸收(OD260)单核苷酸ssDNA(或RNA)dsDNA5.核酸的化学性质核酸中的嘌呤和嘧啶能进行脱氨、聚合、烷基化等反应等。脱氨：C→U脱氨：C→UATCGAATTGCATUGAATTAC千万年后，G–C将不复存在•聚合紫外光诱导两个相邻嘧啶之间形成二聚体CH3NHNOOCH3NHNOORRPPPCH3NHNOOCH3NHNOORRPPP紫外光图3-25胸腺嘧啶二聚体的形成二、DNA的变性(denaturation)定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。变性后其它理化性质变化：OD260增高粘度下降浮力密度升高酸碱滴定曲线改变生物活性丧失DNA变性的本质是双链间氢键的断裂例：变性引起紫外吸收值的改变DNA的紫外吸收光谱增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。热变性解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。Tm：DNA变性时紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度(meltingtemperature,Tm)。•影响Tm的因素：1.G+C含量:G+C越高，Tm越高2.DNA样品均一性：均一的DNA样品，Tm范围较狭窄。3.核酸的种类：双链RNA＞RNA-DNA杂交链＞DNA双链4.溶液的离子强度：离子强度高，Tm值高。三、DNA的复性与分子杂交DNA复性(renaturation)的定义在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。减色效应DNA复性时，其溶液OD260降低的现象。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing)。不同来源的核酸链分子复性时形成杂化双链过程叫分子杂交。这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。核酸分子杂交(hybridization)核酸分子杂交的应用研究DNA分子中某一种基因的位置确定两种核酸分子间的序列相似性检测某些专一序列在待检样品中存在与否是基因芯片技术的基础核酸酶核酸酶是指所有可以水解核酸的酶核酸酶的分类依据底物不同分类•DNA酶(deoxyribonuclease,DNase)：专一降解DNA。•RNA酶(ribonuclease,RNase)：专一降解RNA。依据切割部位不同•核酸内切酶：分为限制性核酸内切酶和非特异性限制性核酸内切酶。•核酸外切酶：5´→3´或3´→5´核酸外切酶。参与DNA的合成与修复、RNA合成后的剪接等重要基因复制和基因表达过程负责清除多余的、结构和功能异常的核酸，同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸在消化液中降解食物中的核酸以利吸收体外重组DNA技术中的重要工具酶生物体内的核酸酶负责细胞内外催化核酸的降解核酸酶的功能核酶催化性DNA(DNAzyme)人工合成的寡聚脱氧核苷酸片段，也能序列特异性降解RNA。催化性RNA(ribozyme)作为序列特异性的核酸内切酶降解mRNA。