重组Kinectin蛋白的表达及纯化

，黄绍明2，莫发荣1，何少健1，周素芳3，闫磊1，谢小薰1，罗国容11广西医科大学组织与胚胎学教研室，南宁（530021）2广西医科大学解剖学教研室，南宁（530021）3广西医科大学生物化学教研室，南宁（530021）E-mail：[e-mail]摘要：目的：探讨重组kinectin蛋白的诱导表达及纯化条件。方法：以pMAL-C2为载体构建重组质粒，并转入TB1宿主菌。通过不同的诱导温度、诱导时间、IPTG浓度以及IPTG加入时机对TB1工程菌进行诱导比较，探讨较理想的诱导表达条件。诱导产物过Amylose-resin亲和层析柱进行纯化。结果：TB1工程菌在37℃振荡培养2个小时后加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，降低温度到34℃继续诱导3个小时，可获得理想诱导效果；诱导产物经过柱纯化后，可获得较纯的MBP-kinectin融合蛋白。结论：pMAL-C2载体可用于kinectin的体外基因重组表达；通过对诱导及过柱条件的优化，可获得较高的MBP-kinectin融合蛋白表达效率及纯度。关键词：肿瘤抗原；kinectin；基因重组；蛋白表达；纯化中图分类号：R735.7文献标识码A1.引言肝细胞癌（ＨＣＣ）是死亡率很高的一种恶性肿瘤，目前其诊疗仍缺乏特异性，寻找HCC相关抗原是当前HCC防治研究的一个迫切任务。本课题组应用SEREX（serologicalanalysisofrecombinantcDNAexpressionlibraries）技术，从广西人HCC的cDNA文库中筛选出了一系列HCC相关的抗原基因[1,2]，其中编号为HCC-27-9-3的基因序列与kinectin的N末端同源，且初步检测表明，其抗体在HCC病人中有较高的特异性和阳性率[3]。本研究在对此kinectin蛋白进行了体外重组、克隆及表达的基础上[4]对其诱导及纯化条件进行了优化，为其开发应用奠定了基础。2.材料与方法2.1材料:HCC-27-9-3重组噬菌粒为本室自存；大肠杆菌DH5α和TB1、质粒pMAL-C2、Amyloseresin亲和层析填料均为NewEnglandBiolabs公司产品；IPTG为北京夏斯生物公司产品；X-gal、Taq酶、dNTP、BamHI、HindIII和低分子量标准蛋白均为Fermentas公司产品；XmnI为Promega公司产品；T4DNA连接酶为MBI公司产品；小分子量胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司；DNAmarker购自北京鼎国生物工程公司；PEG8000为BBI公司产品；其余化学试剂均为国产分析纯。SDS-PAGE由3%浓缩胶和12%分离胶组成，凝胶中蛋白的定量分析软件为BIO-RAD公司的QuantityOne凝胶分析软件；引物均由上海生工合成；蛋白的飞行质谱测序分析送复旦大学进行。2.2方法2.2.1重组质粒的构建及鉴定：1本课题得到国家自然科学基金（编号：30460037）、高校博点专项基金（编号：20050598006）和广西科技厅基金（编号：0542068）的资助。载体质粒中，先转入DH5a菌，经蓝白斑实验、PCR法、酶切法及DNA测序筛选出正确的重组子后，再转入TB1表达宿主菌。2.2.2目的基因在表达宿主菌中的诱导表达：将转有正确重组质粒的TB1工程菌置于LB-Amp+板中培养过夜后，挑单克隆至3mlLB-Amp+培养液中,37℃恒温振荡培养至OD600为0.4,取1ml留作诱导前对照，余加入100mmol/L的IPTG至终浓度0.5mmol/L,继续诱导3个小时，8000r/min离心10min，弃上清，收集菌体，凝胶电泳鉴定。收集上述方法诱导的工程菌菌体，每克菌体沉淀加入15ml过柱缓冲液，置冰浴中，超声波破菌3个周期（每个周期20次，每次3秒，间歇4秒），4℃12000r/min离心30min，分别收集上清液及沉淀，SDS-PAGE电泳鉴定，以了解重组蛋白的分布情况。2.2.3诱导条件的优化探索：将转有TB1工程菌单克隆的培养液37℃振荡培养过夜后，按1:100比例分别转种到3组含10mlLB－Amp+培养液的大离心管中，37℃培养2h后，加入IPTG，分别在37℃、34℃和30℃继续诱导3个小时，将诱导产物及其经超声破菌后的上清和沉淀分别走12％SDS-PAGE电泳，Quantityone软件分析比较，以探讨较理想的诱导温度。同上方法，将TB1工程菌分别转种到6组各7管含5mlLB－Amp+培养液的大离心管中。37℃培养2h后，加入IPTG（终浓度0.5mmol/L），将温度降至34℃（前面实验表明此为较佳诱导温度，后同），分别继续诱导1h、2h、3h、4h、5h、6h后收集菌体，走12%SDS-PAGE电泳，分析诱导时间长短对蛋白质表达量的影响。同上方法，将TB1工程菌分别转种到6组各7管含5mlLB－Amp+培养液的大离心管中。37℃培养2h后分别加入IPTG至终浓度0.2、0.5、0.8、1.0、2.0和3.0mmol/L。随后降低温度至34℃继续培养3h（前面实验表明此为较佳诱导时间，后同），离心收集菌体，走12%SDS-PAGE电泳，分析不同IPTG浓度对蛋白表达量的影响。同上方法，将TB1工程菌分别转种到7组各7管含5mlLB－Amp+培养液的大离心管中，37℃分别培养至第1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h后，加入终浓度0.5mmol/L的IPTG（前面实验表明此为较佳诱导浓度，后同），转至34℃继续培养3h，离心收集菌体，走12%SDS-PAGE电泳，分析IPTG在不同时机加入对蛋白表达量的影响。2.2.4统计学处理：实验数据的处理分析采用多个样本均数的比较，分析软件为PEMS，方差齐性检验水准：α=0.10，方差分析检验水准：α=0.05。2.2.5融合蛋白的分离纯化：方法按NewEnglandBiolabs公司的Amylose-resin亲和层析说明书稍加改进进行。另外，对诱导及纯化的条件进行优化，以抑制细菌蛋白酶的水解作用，如诱导时在培养液中加入0.2%的葡萄糖，破菌时加入1mmol/L的PMSF，冰浴中破菌，在低温的环境中过柱。最后对条件优化前后的纯化效果进行比较。收集蛋白洗脱液后，12%SDS-PAGE电泳鉴定纯度，并送质谱分析，测定氨基酸序列。3.结果3.1重组质粒的构建与鉴定：构建的重组质粒经蓝白斑实验、PCR鉴定及酶切鉴定筛选后，送基因测序，结果表明，所插入目的基因序列及读码框架完全正确。3.2目的基因在表达宿主菌中的诱导表达：将重组质粒转入TB1宿主菌，并经IPTG诱导后，SDS-PAGE电泳显示，在66.2kDamarker下方可见一诱导条带（图1），而未诱导的对照则未见有此条带。工程菌未诱导产物；BTB1工程菌诱导产物；CproteinmarkerQuantityone凝胶分析软件分析结果提示，目的蛋白分子量约为62.374kDa，与MBP-Kinectin理论分子量的61kDa大致相符（图2）。目的蛋白约占菌体蛋白总量的12.9%（图3）。3.3诱导条件的优化：工程菌经不同条件诱导后的产物走12％SDS-PAGE电泳，并进行光密度分析以进行定量比较。34℃条件下，诱导时间长短与目的蛋白表达百分含量的关系如图4。图3目的蛋白条带的光密度分析图2目的蛋白的分子量估算的产物为对照，表示差异无显著性，◆表示差异有显著性。加入不同浓度IPTG诱导时，目的蛋白表达百分含量的光密度分析结果如下（图5）：图5IPTG浓度和蛋白表达百分含量的关系图以IPTG浓度为1mmol/L时的诱导产物百分含量为对照，表示差异无显著性，◆表示差异有显著性。不同时机加入IPTG进行诱导的产物电泳结果见图6，由图可见，TB1工程菌在37℃振荡培养两个小时后加入IPTG，诱导效果较好。经OD值检测，此时细菌的OD值约为0.4左右。、C、D、E、F、G、H分别为第1、2、3、4、5、6、7个小时后加入IPTG诱导的产物I为DH5α工程菌于第2个小时加入IPTG诱导的对照J为空白TB1菌于第2个小时加入IPTG诱导的对照。3.4融合蛋白的分离纯化：经优化诱导条件后，将工程菌菌体超声破菌产物的上清液和沉淀分别走12％SDS-PAGE电泳，结果提示，目的蛋白大部份以可溶性的形式存在。将上清液过柱纯化，获取的MBP-Kinectin蛋白电泳后或多或少都会出现一些杂带。这些杂带主要位于36.0kDa－66.2kDa之间（即分子量大致介于MBP与MBP-Kinectin之间）（图7）。目的蛋白百分含量52.334.329.619.916.9010203040506023456目的蛋白百分含量经优化条件后，可大大减少杂带蛋白的出现（图8）。经优化条件后，可减少杂带蛋白的出现（图8）。图7过柱洗脱收集液电泳图：左图：Amarker；B、C、D、E、F、G、H、I分别为第1、2、3、4、5、6、7、8管蛋白洗脱收集液；J为过柱穿透液。右图：各管蛋白洗脱收集液中目的蛋白百分含量直方图（纵坐标为百分含量，横坐标为管数）。将纯化后的融合蛋白送质谱测序分析，结果表明：1、重组蛋白的氨基酸序列完全正确；2、纯化产物中存在有许多序列与融合蛋白氨基酸序列相一致的多肽片断。4.讨论kinectin是一种与囊泡转运相关的膜受体蛋白，其最早发现定位于鸡胚脑细胞的内质网膜上，主要功能是参与细胞内囊泡的转运[5]。后来，kinectin还陆续被发现与一些细胞内的功能及信号蛋白相关，如整合素、Rho家族蛋白、EF1复合体等。这些蛋白在细胞的分裂、分化及骨架构建中都发挥着极其重要的作用，可能与肿瘤的发生和发展密切相关[6，7，8]。本课题组罗国容等[2]用SEREX技术在肝癌患者血清中检测到了抗kinectin抗体，前期研究表明，其在肝癌患者中有较高的特异性和阳性率，且与AFP有一定的互补性。抗kinectin抗体有望成为一种新型的肝癌诊断标志物，其与AFP的联合检测有望提高肝癌患者的早期检出率[3]。另外，Hirano[9]和陆瑜等[10]也分别在再生障碍性贫血和白塞病中检测到了抗kinectin的抗体。令人感兴趣的是，尽管kinectin表达广泛[11]，但在再生障碍性贫血及肝癌中，却未见有kinectin抗体介导的自身免疫攻击机体其它正常组织器官的报道，表明，kinectin介导的自身免疫对病变细胞可能有一定的特异性。这也提示我们，激活针对kinectin的CTL有可能用于对肝癌的免疫治疗。从更深的层次来看，再障和白塞病都属于自身免疫性疾病；而肝癌为自身细胞发生异常导致的疾病，针对肿瘤细胞的免疫从某种程度上来说也是一种自身免疫。对kinectin的血清学及免疫学分析将为探讨这些疾病的发病机理及内在联系提供一个新的契入点。通过基因工程大量获取kinectin蛋白是对其进行深入研究和探讨的前提和基础。pMAL-C2载体系统是一种较好的抗原蛋白表达体系，本实验首次以此体系重组构建了肝癌相关的kinectin基因片断，并且诱导表达出了MBP-kinectin融合蛋白[4]，同时对影响重组蛋白表达的几个重要因素：诱导温度、诱导时间、IPTG浓度及IPTG加入时机进行了优化：1）温度是进行重组蛋白表达的基本平台[12]，其主要通过影响蛋白质的合成速度、包涵体的形成概率及细