重组人生长激素促进肝癌血管新生的体外研究

重组人生长激素促进肝癌血管新生的体外研究王鹰，李苏宜东南大学医学院，南京（210009）E-mail：[e-mail]摘要：目的：观察重组人生长激素（rhGH）通过不同生长激素受体（GHR）表达的肝癌细胞株，对共培养的人脐静脉内皮细胞增殖的影响。方法：免疫细胞化学方法筛选生长激素受体（GHR）阳性和阴性的细胞株，分别与ECV共培养。以不同浓度的rhGH（50ng／ml、250ng／ml、空白对照）进行干预。描绘细胞生长曲线，流式细胞仪检测周期比例，酶联免疫吸附实验测定肝癌细胞分泌的血管内皮生长因子（VEGF）的浓度。结果：Bel-7402（GHR阳性）在rhGH干预后分泌VEGF水平提高，与之共培养的ECV生长加速，细胞S期比例显著升高，呈现rhGH浓度依赖性（P0．05）。而SMMC-7721（GHR阴性）尽管能促进ECV增殖，但不受rhGH影响，分泌的VEGF无变化（P0．05）。结论：rhGH可诱导GHR(+)肝癌细胞分泌VEGF，间接促进血管内皮细胞增殖。关键词：生长激素，生长激素受体，血管生成，共培养中图分类号：R730.530引言肿瘤患者处于高分解代谢状态，单纯的代谢支持不能明显地逆转这种状态。重组人生长激素（GH）作为一种高效的促合成代谢因子，在加速伤口愈合、降低死亡率方面疗效卓著，但是代谢调理治疗在改善全身症状的同时，是否会促进原有肿瘤的生长、转移和复发，仍存在争议。有报道认为GH不仅可促进肿瘤细胞增殖，而且可能与肿瘤血管新生有关，但尚无明确证据[1]。本课题组以往的研究发现，GH发挥促细胞增殖效应可能与生长激素受体（GHR）有关[2，3]。因此，本实验筛选GHR表达不同的两株肝癌细胞，观察GH在与肝癌细胞共培养的内皮细胞体外增殖中的作用。1材料与方法1.1材料与试剂人肝癌细胞(Bel－7402、SMMC－7721)和人脐静脉内皮细胞(ECV)由东南大学医学院中心实验室提供。基因重组人生长激素（rhGH，珍怡）由上海联合赛尔生物工程有限公司惠赠。主要实验试剂有：RPMI-1640（GIBCO公司），胰酶（GIBCO公司），Hepes（GIBCO公司），胎牛血清(天津灏洋TBD)。Transwell小室购自美国CorningCostar公司。VEGFELISA试剂盒购自美国ADL公司。主要实验仪器包括超净工作台(苏州净化设备厂)，CO2培养箱(美国Shel-Lab2300型)，倒置相差显微镜(日本OlympusCK2型)，流式细胞仪（德国Partec公司）。1.2实验方法1.2.1细胞培养ECV、Bel-7402、SMMC-7721细胞培养液均为含10%胎牛血清的RPMI-1640。所有细胞都培养在37℃的含5%CO2饱和湿度培养箱中。取对数生长期的ECV细胞接种于六孔板Transwell共培养装置的下室(聚碳酸酯膜、孔径0.4μm)，待ECV贴壁后，1×10^5个Bel-7402或SMMC-7721细胞直接加入Transwell共培养装置的上室进行共培养（图1）。细胞接种密度都必须均匀。分为SMMC-7721/ECV共培养组、Bel-7402/ECV共培养组、ECV单独培养组。每个组均按照rhGH浓度的不同，分为三个亚组：rhGH50ng／ml组、rhGH250ng／ml组、空白对照组。干预后取出ECV进行细胞周期检测和细胞生长曲线绘制。Bel-7402单独培养组和SMMC-7721单独培养组则用不同浓度rhGH（同上）干预后，取细胞培养上清液，进行VEGF蛋白浓度的定量检测。图1细胞共培养示意图Figure1Transwellsystem1.2.2免疫细胞化学应用免疫细胞化学方法测定Bel-7402和SMMC-7721细胞膜上的GHR，操作步骤按照说明书进行。阳性判断标准：以细胞浆呈棕黄色为阳性。1.2.3流式细胞分析应用流式细胞仪检测rhGH干预前后ECV细胞的周期比例，每组设3个复孔，每次检测均设阴性对照。用Multicycle软件分析细胞周期(激发波长为488nm)。1.2.4酶联免疫吸附实验(ELISA)应用ELISA方法测定rhGH干预前后Bel-7402或SMMC-7721细胞分泌到培养液中的VEGF蛋白浓度。操作步骤按照说明书进行。每组设5个复孔。1.3统计学方法所有数据以均数±标准差(X—±S)表示，两样本均数比较用t检验，结果用SPSS11.5软件处理。2．结果2.1GHR表达情况免疫细胞化学分析表明：BEL-7402细胞染为褐色,主要为胞膜、胞浆着色，说明GHR为阳性（图2）；SMMC-7721细胞无明显染色，说明GHR为阴性（图3）。因此，本实验选取BEL-7402和SMMC-7721细胞作为GHR（+）/GHR（-）对照。上室下室六孔板Transwell小室聚碳酸滤膜0.4μm孔径说明：BEL-7402细胞染为褐色,主要为胞膜、胞浆着色，说明GHR为阳性，SP×40，SP×200图2BEL-7402细胞的免疫细胞化学结果Figure2ImmunocytochemistryofBEL-7402说明：SMMC-7721细胞无明显染色，说明GHR为阴性，SP×40，SP×200图3SMMC-7721细胞的免疫细胞化学结果Figure3ImmunocytochemistryofSMMC-77212.2内皮细胞生长曲线ECV单独培养组在rhGH干预后各亚组的生长曲线基本重叠，统计学没有明显差异(P0.05)。与SMMC-7721共培养后，ECV提前进入对数生长期，第7天即达到生长高峰，但不同rhGH浓度亚组之间比较无显著性差异(P0.05，图4)。与BEL-7402共培养后，ECV增殖更快，第4天即进入对数生长期，上升幅度大，细胞倍增时间缩短为1天，生长高峰前移，各不同rhGH浓度亚组的ECV生长曲线明显分离，其中rhGH250ng/ml亚组的ECV第5天即到达生长高峰，不同rhGH浓度亚组之间比较均有显著性差异(P0.05，图5)。图4rhGH干预SMMC7721/ECV共培养组的ECV生长曲线，与ECV单独培养进行对比Figure4ThegrowthcurveofECVco-culturedwithSMMC7721afterrhGHintervention，ComparedwithECVControl细胞生长曲线，与ECV单独培养进行对比Figure5ThegrowthcurveofECVco-culturedwithBEL7402afterrhGHintervention，ComparedwithECVControl2.3ECV细胞周期检测流式细胞仪分析结果：在rhGH干预48h前后，ECV单独组的细胞周期比例无显著差异(P0.05,表1）。与SMMC-7721共培养，并用rhGH干预48h后，ECV的DNA合成期(S期)比例有所升高，但统计学无显著性差异(P0.05,表2)。与BEL-7402共培养，并用rhGH干预48h后，ECV的S期比例与对照组相比明显增加，均呈现出rhGH剂量依赖性(P0.05)，而G2期细胞比例则随着rhGH干预浓度的增加呈下降趋势(P0.05，表3)。表1rhGH干预后ECV细胞周期比例Table1FCMcycleratioofECVafterrhGHinterventionnG0-G1期S期G2期空白对照组361.56%±1.8535.16%±0.863.27%±1.88rhGH50ng/ml组358.52%±1.2735.69%±0.705.79%±0.58rhGH250ng/ml组361.75%±0.8033.46%±0.085.68%±1.79说明：经t检验比较，各细胞周期比例无显著性差异(P0.05)表2rhGH干预SMMC7721和ECV共培养组的ECV细胞周期比例Table2FCMcycleratioofECVco-culturedwithSMMC7721afterrhGHinterventionnG0-G1期S期G2期空白对照组352.24%±1.0739.94%±0.967.82%±2.02rhGH50ng/ml组353.77%±1.1636.72%±1.569.52%±0.40rhGH250ng/ml组350.89%±0.9838.46%±1.6010.65%±2.57说明：经t检验比较，各细胞周期比例无显著性差异(P0.05)表3rhGH干预BEL7402和ECV共培养组的ECV细胞周期比例，各组t检验比较差异有显著性(P0.05)Table3FCMcycleratioofECVco-culturedwithBEL7402afterrhGHinterventionnG0-G1期S期G2期空白对照组355.22%±0.9734.36%±1.1510.42%±0.19rhGH50ng/ml组354.38%±0.8741.25%±0.784.37%±1.65rhGH250ng/ml组352.36%±1.2847.46%±1.340.19%±0.06说明：经t检验比较，S期比例随rhGH浓度升高而增加，G2期比例随rhGH浓度升高而减少(P0.05)小时后，提取培养液上清，用ELISA方法检测上清液中的VEGF浓度。结果显示：VEGF浓度在rhGH250ng/ml组和rhGH50ng/ml组均明显高于空白对照组(P0.05)，rhGH250ng/ml组的VEGF浓度高于rhGH50ng/ml组(P0.05，表4，图6)。作为阴性对照组，SMMC-7721细胞在rhGH干预48小时后，上清液中的VEGF浓度无明显变化。无论是rhGH250ng/ml组、rhGH50ng/ml组和空白对照组相比，还是rhGH高低浓度组之间相比，均无显著差异(P0．05，表4，图6)。表4VEGF浓度(pg/ml)Table4VEGFconcentrationinsupernatantliquid(pg/ml)nSMMC7721BEL7402空白对照组588.012±4.21114.179±3.11rhGH50ng/ml组592.630±3.27125.499±2.68rhGH250ng/ml组590.004±3.04131.312±2.56图6VEGF浓度(pg/ml)Figure6VEGFconcentrationinsupernatantliquid(pg/ml)3．讨论GH发挥生物学作用是通过与不同组织特异性的GHR结合开始的。GHR与GH结合后，形成同型二聚体，与之偶联的JAK2激活，通过转磷酸作用，触发多级信号级联放大，通过Elk-1，STATs和PI3K等转录因子，诱导胰岛素样生长因子（IGF）表达，进而介导细胞增殖和致癌效应[4,5,6]。以往的研究忽略了GHR的检测和筛选，仅以个别受体表达情况不明的肿瘤细胞株为研究对象，从而断定GH促进或不促进肿瘤生长，显然缺乏一定的分子依据[2,3,7]。根据是否表达GHR，我们采用免疫组化方法筛选出GHR(+)细胞株BEL-7402和GHR(-)细胞株SMMC-7721，在此基础上科学地设立GHR(+)/(-)细胞株互为对照，排除了GHR(-)对实验结果的干扰。在此基础上，我们利用transwell小室，建立GHR(+)/(-)细胞株分别与ECV细胞共培养体系，模拟肿瘤血管内皮细胞的生长环境，克服了实验的技术难点和单一细胞研究的片面性[8]。本实验结果显示：在rhGH干预后，ECV生长曲线和细胞周期比例均没有变化，说明rhGH对于