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博士、硕士专业学位名称临床医学博士兽医博士口腔医学博士法律硕士教育硕士工程硕士建筑学硕士临床医学硕士工商管理硕士农业推广硕士兽医硕士公共管理硕士口腔医学硕士公共卫生硕士军事硕士会计硕士体育硕士艺术硕士风景园林硕士汉语国际教育硕士翻译硕士目录提要…………………………………………………………………1第一章前言………………………………………………………2第二章实验仪器和材料…………………………………………10第三章rhGH相关蛋白质的确定与研究………………………11第四章rhGH冻干制剂缓冲体系的筛选与确定…………………16第五章rhGH冷冻干燥配方筛选及研究…………………………33总结……………………………………………………………46参考文献…………………………………………………………47中文摘要…………………………………………………………50英文摘要…………………………………………………………521提要人生长激素（HumanGrowthHormone）是由脑垂体前叶含有嗜酸性粒细胞所分泌的、由191个氨基酸残基构成的肽类激素，是人体内促进生长的主要激素。high在水溶液中不稳定，易产生氧化、脱酰氨、聚合等变化。文献报道生长激素的氧化位点主要发生在14位和125位的蛋氨酸残基上。生长激素发生氧化、脱酰氨反应之后，其生物活性也会随之下降，氧化和脱氨组分的存在被认为是质量下降的重要表现。另外，剧烈震荡、高温等条件下生长激素易形成二聚体和多聚体，从而降低或丧失生物学活性。因此，防止氧化、脱酰氨、聚合是生长激素制剂研究中的重点，在贮存和运输的过程中保证生长激素的质量和稳定性是非常必要的。冷冻干燥技术是保护重组蛋白质活性最为常见也是最为重要的一种方法，一个好的冻干配方制成的冻干制剂能够长期保持蛋白质或多肽的活性。为此，本论文通过选择缓冲液,摸索其浓度、pH，加入一定量的保护剂、赋形剂和表面活性剂，并对每种添加组分及相关参数进行了一系列摸索、筛选、检测实验，最终确定rhGH冻干制剂配方组成及参数。通过冷冻干燥技术，最大限度维持了重组人生长激素在贮存过程中的稳定性，延长了药品的有效期。2第一章前言19世纪，人们在人的脑垂体前叶提取并分离出一种对生长有作用且具有活性的成份，命名为生长激素[1]（GrowthHormone，GH）。研究证明，生长激素对骨骼，内脏和全身的生长都有重要作用，而且对蛋白质合成、脂肪、糖类的代谢速率都有影响，故生长激素在人体生长发育中是不可或缺的。1.1人生长激素与重组人生长激素（RecombinantHumanGrowthHormone，rhGH）人生长激素是由191个氨基酸残基构成的单一肽链的激素，分子量为22KD左右，有2个二硫键[2]，pI=5.2，分子中无糖基化。high的基本功能是刺激机体组织的发育，促进人体的骨骼，软骨和组织的生长，生长激素对中间代谢及能量代谢也有影响。具体可促进蛋白质合成，增强对钠、钾、钙、磷、硫等重要元素的摄取与利用，同时通过抑制糖的消耗，加速脂肪分解，使能量来源由糖代谢转向脂肪代谢。人在幼年时，如果生长激素分泌不足，会导致生长发育迟缓，身体长得特别矮小，称“侏儒症”；如果生长激素分泌过多，可引起全身各部过度生长，骨骼生长尤为显著，致使身材异常高大，称“巨人症”。成年后，骨骺已融合，长骨不再生长，此时如生长激素分泌过多，将刺激肢端骨、面骨、软组织等增生，表现为手、足、鼻、下颌、耳、舌以及肝、肾等内脏显示出不相称的增大，称“肢端肥大症”。对侏儒症应尽早给予生长激素治疗，巨人症和肢端肥大症如果是垂体前叶肿瘤所致，可进行局部放射线照射治疗或手术切除，大剂量雌激素有抑制垂体分泌生长激素的作用。早在二十世纪八十年代，由于生长激素来源稀少，导致其未能得到广泛应用[3]。近年来科学家已用基因工程方法将人类生长激素基因从染色体DNA链上分离出来，重组到质粒上，并用大肠杆菌进行表达，依靠大肠杆菌发酵生产重组人生长激素。rhGH的氨基酸含量、空间构象及序列与人生长激素完全相同，具有与人体内源性生长激素等同的生物学作用：刺激骨骺端软骨细胞分化、增殖，刺激软骨3基质细胞增长，刺激成骨细胞分化、增殖，引起线性生长加速及骨骼变宽；促进全身蛋白质合成，纠正手术等创伤后的负氮平衡状态，纠正重度感染及肝硬化等所致低蛋白血症；刺激免疫球蛋白合成，刺激淋巴样组织、巨噬细胞和淋巴细胞的增殖，增强抗感染能力；刺激烧伤创面及手术切口胶原体细胞合成纤维细胞以及巨噬细胞分裂增殖，加速伤口愈合；促进心肌蛋白质合成，增加心肌收缩力，降低心肌耗氧量，调节脂肪代谢，降低血清胆固醇、低密度脂蛋白的水平；补充生长激素分泌不足或缺乏，调节成人的脂肪代谢、骨代谢、心肾功能。生长激素的临床应用已有近半个世纪，大量的动物实验及临床研究表明生长激素疗效确切，副作用极少[4-6]。1.2重组人生长激素的发展史19世纪，研究人员发现了对生长有重要作用的物质，这种物质是由人的脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的蛋白激素，并命名为生长激素（GroH）现。1957年，Raben首次从人脑垂体中分离出人生长激素（high）随后开始用于儿童侏儒症的治疗，但是由于人的垂体来源有限，产量稀少，在使用过程中因为用量不够，而不能满足增高的需求，另外由于其易受high供体病毒感染，于1985年被FDA禁止使用[7]。1979年，随着生物技术的快速发展，基因工程技术的成功应用使得high在大肠杆菌中的表达成为可能，最初合成的大肠杆菌源性的重组人生长激素(rhGH)与天然high相比，在N-末端多了一个蛋氨酸残基，为192肽。其提取工艺复杂，容易产生抗体，生物活性偏低，在人体内容易引起免疫反应而影响增高效果[8]。20世纪80年代中期，美国Genentech公司研制出了N端去除蛋氨酸的191肽重组人生长激素，其结构和生物功能与人生长激素（high）完全相同，从此，生长激素的应用在全球得以扩大[9]。20世纪80年代末期，在哺乳动物细胞模型中成功的合成了含有191个氨基酸的人生长激素，优点在于应用该方法合成的生长激素与天然的生长激素结构最为接近，但存在无法克服的缺点：①细胞培养无菌及环境要求较高、培养周期长、收率较低；②动物源性感染；③会导致肿瘤的生长。目前仅有极少数厂家生产[10]。20世纪90年代，金磊大肠杆菌分泌表达技术[11]合成的重组人生长激素具有4氨基酸含量、序列和蛋白质结构与人垂体分泌的生长激素完全一致，生物活性、效价、纯度和吸收率极高，在降低生产及治疗成本的同时确保产品的安全性、有效性和稳定性的优点。该技术被国际大多数领先企业采用，其生产的产品已占据全球95%以上的市场。经过多年研究后，国内的基因重组人生长激素的生产技术也取得了突破性进展，1998年，归国博士金磊创办了长春金赛药业股份有限公司，应用分泌型表达技术成功的在中国上市了第一支重组人生长激素——注射用重组人生长激素金磊®赛增®，填补了国内空白，结束了长期依赖进口国外产品的历史。经过10余年的临床应用证明，长春金赛药业股份有限公司采用的大肠杆菌分泌型表达是一种最成熟和最稳定的重组人生长激素生产技术，采用该技术生产的产品活性高，副作用小，是一种安全、有效的生长激素。此公司于2005年又上市了亚洲第一支重组人生长激素注射液（水剂），水剂保持了生长激素的原始状态，具有生物活性高、产生的抗体少、见效速度快、副作用相对较少，如长期治疗其效果明显等优点[12]。1.3生长激素（GH）的功能及在临床方面的应用在生长激素被发现的初期，由于来源有限，产量稀少，只能用于因生长激素缺乏或不足而导致的儿童矮小症。随着生物技术的发展，基因重组人生长激素的问世，临床用量得到了保证。随着对生长激素研究的深入，人们发现生长激素可治疗成人生长激素缺乏（GHD）、组织修复、艾滋病消瘦、烧烫伤、Turner氏综合症等症状。近年来，随着科学技术不断的发展，对生长激素的临床研究也不断深入，发现生长激素在抗衰老、骨质疏松症、心脑血管疾病治疗方面也有很好的效果[13-15]。1.4研制重组人生长激素冻干制剂的背景和意义1.4.1影响重组人生长激素不稳定性的外界因素重组人生长激素(rhGH)受物理或化学因素的影响很大，在外界条件发生变化时，重组人生长激素的性质常有所改变，因此会表现出不稳定的性质。人们把多肽和蛋白质的不稳定性分为两种：即物理不稳定性和化学不稳定性[16]。（1）物理不稳定性的影响5在物理不稳定性中，最常见的类型是聚合反应。生长激素的结构非常复杂，而温度和pH值就是影响其稳定性的主要因素。外界温度越高，稳定性就会越差。当蛋白质暴露在生理环境或与有机溶剂接触时易发生蛋白聚合，形成非正确折叠导致的蛋白聚合体[17]。一些物理因素如增加压力、剧烈搅拌、温度急降和射线等也都会使rhGH的聚合物加速形成。由于重组人生长激素结构的复杂性，温度对重组人生长激素的结构和生理功能的影响很难总结。在一般情况下，提高温度，重组人生长激素结构越容易发生变化，其稳定性也越差[18-20]。蛋白质和多肽类生物制品一旦处于极端pH值时，其分子间的静电排斥力将增加，会降低静电自由能并导致蛋白质的错误折叠甚至变性。此外，盐桥也是维持蛋白质构象不可或缺的因素，虽然其数目很少，但贡献很大，而极端的pH值会减少盐桥的形成，导致蛋白质稳定性的降低，使更其趋向于聚合[21]。（2）化学不稳定性的影响化学不稳定性涉及共价键的合成和断裂的过程，生成新的化学实体，常见类型如下：1)脱酰胺反应。重组人生长激素的脱酰胺作用主要发生在149位和152位的天冬酰胺残基上。脱酰胺反应的动力学主要受外在因素影响，例如pH、温度和离子强度等，添加剂对脱酰胺反应速度的影响也很大。非酶催化的脱酰胺反应与环境条件和多肽的结构有关，提高或降低pH值、升高或降低温度都将影响脱酰胺反应的进行。2）氧化反应。重组人生长激素被氧化的主要原因是由于溶液中会溶解了氧，其分子中处与14位和125位的甲硫氨酸易发生氧化反应。蛋白质和肽氧化作用通常分为两大类：即特定的氧化反应和非特定氧化反应，其氧化率受内在和外在两个因素影响。内在因素包括肽链的活性和蛋白质整体结构的影响。外在因素诸如pH值和缓冲液等条件，也直接会影响蛋白质的氧化率。虽然目前认为rhGH的脱酰胺和氧化形式没有生物毒性，生物活性或受体结合特性的改变也很少，但是与天然的rhGH相比较，但是脱酰胺和氧化后的rhGH的稳定性却降低了很多。3）水解反应。多肽中的肽键易水解断裂，在重组人生长激素中，由Asp参与形成的肽键比其它肽键更易断裂。64）二硫键的错配。游离半胱氨酸残基的去除可以大大缓解二硫化物干扰和交换。尽管二硫键的数目在重排前后是相同的，但由于其化学键已经被打断和再连接，会直接导致三级结构改变和活性丧失[22]。1.5提高重组人生长激素稳定性的途径1.5.1聚乙二醇(PEG)修饰聚乙二醇(PEG)修饰是当前生长激素相关研究中的热点。PEG是一种亲水性强的高分子化合物，在体内可降解，无毒。PEG与多肽或蛋白结合后，一方面可提高其溶解度，另一方面由于分子量的增大，能够有利于肾小球的重吸收，从而延长药物的体内半衰期，达到长效的目的。PEG对多肽或蛋白药物的修饰，不会影响到其主要生物学功能——包括与受体结合等等[23,24]。对修饰产物的检测，通常采用高效液相色谱法，其中以体积排阻色谱法（HP-SEC）较为常用法可。1.5.2使用辅料和添加剂在蛋白质药物中加入不同的赋形剂，可使蛋白质类药物稳定性和有效期得以延长。辅料主要包括糖类、盐、表面活性剂和大分子化合物等。低浓度糖类能够使更多的水分子围绕在蛋白质周围，提高重组人生长激素的稳定性；表面活性剂可抑制蛋白质的聚集、沉淀和吸附等物理不稳定性；盐类可以起到稳定蛋白质的作用；大分子化合物稳定蛋白质的作用机制主要包括提高空间隐蔽度、限制蛋白质运动及优先吸附等[25]。1.5.3真空冷冻干燥技术自1935年第一台商用冻干机问世以来，冷冻干燥技术逐步在血液制品、医药、食品、超微细材料等领域得到了较为广泛的应用[26]。真空冷冻干燥的主要