搜索
云南大学学报（自然科学版），２００８，３０（２）：１９８～２０１犆犖５３－１０４５／犖犐犛犛犖０２５８－７９７１犑狅狌狉狀犪犾狅犳犢狌狀狀犪狀犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔重组人甲状旁腺素（狉犺犘犜犎（１－８４））的原核表达及发酵条件初步优化刘丰亮１，常宏１，刘洁２，杨克１，张杰１（１．云南大学生命科学学院，云南昆明６５００９１；２．中国科学院昆明动物研究所，云南昆明６５０２２３）摘要：甲状旁腺激素（犘犪狉犪狋犺狔狉狅犻犱犎狅狉犿狅狀犲，犘犜犎）是治疗骨质疏松症的药物之一．将人工合成全长人犘犜犎（犺犘犜犎（１－８４））的核苷酸序列插入狆犜犺犻狅犎犻狊犃载体中，然后转化大肠杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻．），在犐犘犜犌的诱导下，成功实现了狉犺犘犜犎（１－８４）的原核表达．通过发酵条件的优化，初步确定１∶４０接种犔犅＋３０％犕９盐溶液的发酵培养基，３７℃培养至犗犇６００狀犿＝０．８时，加入终浓度为０．６犿犿狅犾／犔的犐犘犜犌，诱导８犺的较优发酵程序．关键词：甲状旁腺激素；大肠杆菌；表达优化中图分类号：犙７８文献标识码：犃文章编号：０２５８－７９７１（２００８）０２－０１９８－０４骨质疏松症（犗狊狋犲狅狆狅狉狅狊犻狊）是一种由于骨强度受损导致骨折危险增加为特征的骨骼疾病，是严重影响老年人身体健康的三大疾病之一［１］．１９９６年，犠犎犗世界骨质疏松症大会上达成共识认为治疗骨质疏松症的理想药物是甲状旁腺激素（犘犪狉犪狋犺狔狉狅犻犱犺狅狉犿狅狀犲，犘犜犎）．甲状旁腺激素是由甲状旁腺主细胞合成的含８４个氨基酸的多肽，是调节机体钙磷代谢和骨转换的最为重要的肽类激素之一．其直接作用于骨和肾，促进骨钙动员和骨对钙的重吸收，通过促进１－犪羟化酶使２５－犗犎－犇３转化为活性１，２５－（犗犎）２－犇３，间接起到加强肠钙吸收的功能［２，３］．研究表明，犘犜犎通过刺激破骨细胞的活化和形成，来促进骨吸收；通过刺激成骨细胞的形成、增殖及分化，来促进骨形成．通过小剂量、间歇性给药，可以促进骨吸收［４］，从而做到治疗骨质疏松症的目的．由于早期的研究认为犘犜犎的活性位点位于犖端，所以早期的药物研究多以犖端犘犜犎为主，而第１种犘犜犎药物———特立帕肽（又称狉犺犘犜犎（１－３４））已于２００２年作为抗骨质疏松症药物上市［５］．但近几年的研究发现犘犜犎的犆端部分也具有一定的生物活性，尤其是骨细胞大量表达犘犜犎犆端受体的发现［６］，意味着在治疗骨质疏松症方面，犘犜犎（１－８４）比犘犜犎（１－３４）可能更加有效．而由美国犖犘犛－犃犾犾犲犾犻狓公司研发的狉犺犘犜犎（１－８４）在临床Ⅱ和Ⅲ实验中也证实对治疗绝经后的骨质疏松症有效［７，８］．目前国内此方面的研究多以克隆表达犘犜犎犖端部分为主，而针对犘犜犎全长的研究则鲜有报道．本研究基于大肠杆菌密码子的偏爱性及简并性对犺犘犜犎（１－８４）犮犇犖犃序列进行调整，然后克隆和表达犺犘犜犎，并对其发酵条件进行优化．１材料与方法１．１材料大肠杆菌犅犔２１（犇犈３）和质粒狆犜犺犻狅犎犻狊犃由本实验室保存；限制性内切酶犖犱犲Ⅰ和犛犪犾Ⅰ购自犜犪犽犪狉犪公司，犜４犇犖犃连接酶购自犘狉狅犿犲犵犪公司．羊抗犺犘犜犎抗体和碱性磷酸酶标记的兔抗羊抗体均购自晶美公司．１．２方法１．２．１重组质粒狆犜犺犻狅犎犻狊－犘犜犎的构建和鉴定收稿日期：２００７－１１－１５基金项目：国家自然科学基金项目资助（３０３７０３３２）．作者简介：刘丰亮（１９８３－），男，山东人，硕士生，主要从事生物化学与分子生物学方面的研究．通讯作者：张杰（１９６４－），男，云南人，教授，博士生导师，主要从事生物化学与分子生物学及疾病机理方面的研究．犘犜犎基因委托犜犪犽犪狉犪公司合成，基因序列如图１．用犖犱犲Ⅰ和犛犪犾Ⅰ分别双酶切犘犜犎基因和狆犜犺犻狅犎犻狊犃质粒，胶回收酶切片段，犜４犇犖犃连接酶连接，常规氯化钙法转化犅犔２１感受态细胞，筛选阳性克隆．小提质粒，酶切和测序进行鉴定．１．２．２犘犜犎蛋白的诱导表达挑取鉴定正确的单克隆接种于１０犿犔含有１００犿犵／犔犃犕犘的犔犅培养基中，３７℃振荡培养过夜．各取１犿犔种子液接种于１００犿犔含１００犿犵／犔犃犕犘的２×犢犜（１６犵／犔胰蛋白胨，１０犵／犔酵母提取物，５犵／犔犖犪犆犾，狆犎７．０）培养基中，继续培养２．５犺（犗犇＝０．３～０．４）后，按照０．５犿犿狅犾／犔的终浓度加入犐犘犜犌，分别取０，１，２，３犺的培养物１犿犔，高速离心后，去上清，将沉淀－２０℃保存．然后，进行培养基、接种量、诱导时机、诱导时间及犐犘犜犌终浓度的筛选．１．２．３犘犜犎蛋白表达产物的犛犇犛－犘犃犌犈分析将菌液离心获得的沉淀用５０μ犔１×犘犅犛（０．２犵／犔犓犆犾，０．２犵／犔犓犎２犘犗４，８犵／犔犖犪犆犾，２．８７犵／犔犖犪犎犘犗４·１２犎２犗，狆犎７．０）悬浮，加入５０μ犔的１×犾狅犪犱犻狀犵犫狌犳犳犲狉，沸水浴５犿犻狀，超声处理１犿犻狀，１６％的犛犇犛－犘犃犌犈胶电泳，考马斯亮蓝染色．１．２．４犘犜犎蛋白表达产物的犠犲狊狋犲狉狀犅犾狅狋鉴定犘犜犎蛋白表达产物通过犠犲狊狋犲狉狀犅犾狅狋进行特异性检测．将菌液离心获得的沉淀进行犛犇犛－犘犃犌犈胶电泳，８０犞转印到犘犞犇犉膜上，然后５％脱脂奶粉封闭过夜，一抗和二抗孵育后，化学显色．２结果２．１重组质粒狆犜犺犻狅犎犻狊－犘犜犎的构建和鉴定犘犜犎合成序列和狆犜犺犻狅犎犻狊犃经犖犱犲Ⅰ和犛犪犾Ⅰ双酶切，胶回收，犜４犇犖犃连接酶连接，转化犅犔２１（犇犈３）后，将筛选出的阳性克隆小提质粒，进行犖犱犲Ⅰ和犛犪犾Ⅰ双酶切，１％凝胶电泳结果中在接近３００犫狆处有１条带（见图２），表明目的片断已经插入载体中．将犜犪犽犪狉犪公司的测序结果与合成基因的序列进行犅犾犪狊狋比对，表明插入片断未发生突变．２．２犘犜犎蛋白的表达及条件优化２．２．１目的蛋白的表达通过犛犇犛－犘犃犌犈分析，在９．６犽狌附近有１条约１０％～１５％表达量的条带，并且菌体破碎上清和沉淀中皆有犘犜犎蛋白．在犠犲狊狋犲狉狀犅犾狅狋鉴定中，由于一抗为多克隆抗体，导致出现多条条带，但最小的１条条带的分子质量约为９．６犽狌（如图３）．２．２．２培养基的筛选２×犢犜，犔犅，３０％犔犅＋犕９盐溶液，５０％犔犅＋５０％犕９盐溶液，犔犅＋３０％犕９盐溶液及犔犅＋２０％葡萄糖６种备选培养基中，犔犅，犔犅＋３０％犕９盐溶液及犔犅＋２０％葡萄糖中的大肠杆菌生长情况良好（如图４），但由于葡萄糖影响犐犘犜犌对菌体的表达诱导，初步选定犔犅＋３０％犕９盐溶液作为发酵培养基（如图４）．下划线处分别为犖犱犲Ⅰ和犛犪犾Ⅰ酶切位点；：合成基因序列图１犘犜犎（１－８４）氨基酸序列、原始基因序列和合成基因序列比较图犉犻犵．１犜犺犲狆犻犮狋狌狉犲狅犳犘犜犎（１－８４）犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲，狀犪狋狌狉犪犾犵犲狀犲狊犲狇狌犲狀犮犲犪狀犱狊狔狀狋犺犲狋犻犮犵犲狀犲狊犲狇狌犲狀犮犲９９１第２期刘丰亮等：重组人甲状旁腺素（狉犺犘犜犎（１－８４））的原核表达及发酵条件初步优化１：１００犫狆犇犖犃犿犪狉犽犲狉；２：重组质粒狆犜犺犻狅犎犻狊－犘犜犎经犖犱犲Ⅰ和犛犪犾Ⅰ的双酶切结果图２重组质粒狆犜犺犻狅犎犻狊－犘犜犎双酶切犉犻犵．２犇犻犵犲狊狋犻狅狀狅犳狉犲犮狅犿犫犻狀犪狀狋狆犾犪狊犿犻犱狆犜犺犻狅犎犻狊－犘犜犎图３犘犜犎的犠犲狊狋犲狉狀犅犾狅狋分析犉犻犵．３犠犲狊狋犲狉狀犅犾狅狋犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犘犜犎１，６，１１：犗犇６００狀犿为０．４，０．６和０．８时，未诱导菌体的表达情况；２～５：犗犇６００狀犿为０．４时，犐犘犜犌分别诱导２，４，８犺和过夜诱导的菌体表达情况；７～１０：犗犇６００狀犿为０．８时，犐犘犜犌分别诱导２，４，８犺和过夜诱导的菌体表达情况；１２～１５：犗犇６００狀犿１时，犐犘犜犌分别诱导２．４．８犺和过夜诱导的菌体表达情况图４不同诱导时机下蛋白表达的犛犇犛－犘犃犌犈分析犉犻犵．４犃狀犪犾狔狊犻狊狅犳狆狉狅狋犲犻狀犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狌狀犱犲狉犱犻犳犳犲狉犲狀狋犻狀犱狌犮犻狀犵狅狆狆狅狉狋狌狀犻狋狔犫狔犛犇犛－犘犃犌犈２．２．３诱导程序的筛选通过摸索诱导条件，确定了按照１∶４０的接种比例接种到犔犅＋３０％犕９盐溶液培养基中，３７℃培养至犗犇６００狀犿＝０．８时，加入终浓度为０．６犿犿狅犾／犔的犐犘犜犌，诱导４犺后蛋白开始表达，８犺时表达量最高，过夜诱导时表达量比诱导８犺没有明显增加．３讨论基于早期研究结果———犺犘犜犎的生物活性主要由其犖端３４个氨基酸决定，狉犺犘犜犎（１－３４）成为犘犜犎中最早被批准的骨质疏松症治疗药物［５］．但最近的研究表明，犘犜犎调控骨代谢和血钙浓度００２云南大学学报（自然科学版）第３０卷的能力也需要犘犜犎犆端部分的参与［９］．同时由于犘犜犎在血液中会进行代谢，成为各种长度的犘犜犎片断，这预示着狉犺犘犜犎（１－８４）将比狉犺犘犜犎（１－３４）具有更加广泛的用途．因此，本研究克隆并表达犘犜犎（１－８４）．本研究中，犐犘犜犌诱导的大肠杆菌在９．６犽狌处出现１条明显的表达条带．但是可能由于在犠犲狊狋犲狉狀犅犾狅狋中使用的一抗为多克隆抗体，导致其结果出现多条条带，因此需要使用犘犜犎的单克隆抗体进一步确认该表达条带．但由于：①９．６犽狌处的蛋白随诱导时间的延长，表达增加；②重组质粒狆犜犺犻狅犎犻狊－犘犜犎经双酶切和犇犖犃测序分析证实犘犜犎基因插入正确；③在犠犲狊狋犲狉狀犅犾狅狋结果中，其中一条带的分子质量即为９．６犽狌，因此笔者认为该条带处的蛋白即为目的蛋白．以融合蛋白的形式表达目的蛋白现在被越来越多的科研人员所采用．相对于非融合表达，融合蛋白表达形式有其优势：融合表达可以减少外源蛋白在原核生物中被细菌蛋白酶降解，增加表达的产量，特别是增加了可溶性目的蛋白在原核表达系统中的产量［１０］．但本研究为了简化下游的纯化步骤，未采用融合表达形式．狆犜犺犻狅犎犻狊载体含有犎犘－硫氧还蛋白的编码序列，在其翻译起始位点处具有犆犃犜犃犜犌的犖犱犲Ⅰ酶切序列，所以实验中选择使用犖犱犲Ⅰ和犛犪犾Ⅰ双酶切切去犎犘－硫氧还蛋白的方法来构建非融合表达载体．而这可能导致犘犜犎的表达产物在大肠杆菌中被部分降解，而使表达量偏低．此外也有可能是由于目的蛋白对宿主表达菌犅犔２１（犇犈３）有毒性所致［１１］．因此下一步需要确定非融合表达是否是造成犘犜犎的表达量偏低的原因．总之，本研究通过人工合成核苷酸序列，构建了犺犘犜犎（１－８４）的大肠杆菌表达载体，并进行了发酵条件的初步优化，得到了一个较优的发酵条件．下一步拟进行纯化工艺的摸索及建立．参考文献：［１］犖犐犎犮狅狀狊犲狀狊狌狊狊狋犪狋犲犿犲狀狋．犗狊狋犲狅狆狅狉狅狊犻狊犘狉犲狏犲狀狋犻狅狀，犇犻犪犵狀狅狊犻狊，犜犺犲狉犪狆狔［犈犅／犗犔］．２０００，１７（１）：１４５．［２］张凯，王毅，王学谦．重组甲状旁腺激素与骨质疏松关系的研究新进展［犑］．中国骨伤，２００６，１６（９）：３８３３８４．［３］朱亚兰，姚伟，乐超银，等．甲状旁腺激素促进骨形成的研究进展［犑］．山东医药，２００６，４６（７）：７９８０．［４］犙犐犖犔犻狀犵，犚犃犌犌犃犜犜犔犻狕犪犑，犘犃犚犜犚犐犇犌犈犖犻犮狅犾犪犆，犲狋犪犾．犘犪狉犪狋犺狔狉狅犻犱犺狅狉犿狅狀犲：犪犱狅狌犫犾犲犲犱犵犲犱狊狑狅狉犱犳狅狉犫狅狀犲犿犲狋犪犫狅犾犻狊犿［犑］．犜犚犈犖犇犛犻狀犈狀犱狅犮狉犻狀狅犾狅犵狔犪狀犱犕犲狋犪犫狅犾犻狊犿，２００４，１５（２）：６０６５．［５］蒋利华．骨质疏松症药物治疗进展［犑］．中国药业，２００６，１５（４）：３５．［６］犇犐犞犐犈犜犐犘，犐犖犗犕犃犜犃犖，犆犎犃犘犐犖犓，犲狋犪犾．犚犲犮犲狆狋狅狉狊犳狅狉狋犺犲犮犪狉犫狅狓狔犾狋犲狉犿犻狀犪犾狉犲犵犻狅狀狅犳犘犜犎（１８４）犪狉犲犺犻犵犺犾狔犲狓狆狉犲狊狊犲犱犻狀狅狊狋犲狅犮狔狋犻