重组人纤维蛋白片段诱导CIK的增殖及对肺癌耐顺铂细胞的杀伤作用

生物工程学报ChinJBiotech2008,August25;24(8):1373-13[e-mail]©2008InstituteofMicrobiology,CAS&CSM,AllrightsreservedReceived:January8,2008;Accepted:April7,2008Supportedby:theNationalNaturalSciencesFoundationofChina(No.39270765)andHeilongjiangProvinceGrand(No.GOOC190401).Correspondingauthor:ZhihuaWang.Tel:[phone];Fax:[phone];Email:[e-mail]国家自然科学基金资助(No.39270765),黑龙江省重点攻关课题基金项目(No.GOOC190401)资助。研究报告重组人纤维蛋白片段诱导CIK的增殖及对肺癌耐顺铂细胞的杀伤作用任玮,王志华哈尔滨医科大学肿瘤研究所,哈尔滨150081摘要:为探讨重组人纤维蛋白片段(RetroNectin)对CIK(Cytokine-inducedkillercells)细胞活化、增殖的影响及CIK细胞的免疫学特性和对肺癌耐药细胞DDP-A549(DDP:Cisplatin)的杀伤作用。提取健康人外周血中单个核细胞,Ⅰ组细胞接种于前一天用RetroNectin和CD3MAb包被好的培养瓶中,Ⅱ组接种于单独用CD3MAb包被好的培养瓶中,接种当天加入IFN-γ,第二天加入IL-2诱导CIK细胞。细胞计数法测定CIK细胞的增殖,并绘制细胞生长曲线,MTT法测定细胞杀伤活性,流式细胞术分析细胞表型。扫描电镜和透射电镜下观察CIK细胞对DDP-A549的杀伤和DDP-A549细胞的改变。RetroNectin对CIK细胞有很强的激活作用,可使其细胞增殖总数达524.77倍,其主要效应细胞CD3+CD56+可达(31.40±1.91)%;对肺癌耐顺铂细胞DDP-A549的杀伤作用明显高于其亲代药物敏感株A549(P0.01)。但两组CIK细胞对靶细胞的杀伤率在相同效靶比时无明显差异(P0.05)。RetroNectin能显著增强CIK增殖活性,但对CIK细胞的杀伤活性并无明显影响。CIK能够显著抑制DDP-A549的生长,可用于耐顺铂肺腺癌的免疫治疗。关键词:细胞因子诱导的杀伤细胞,RetroNectin,增殖,肺癌细胞,杀伤活性ProliferationandCytotoxicityofRetroNectin-ActivatedCytokine-inducedKillerCellsagainstCisplatin-resistantLungCarcinomaCellWeiRen,andZhihuaWangCancerResearchInstituteofHarbinMedicalUniversity,Harbin150081,ChinaAbstract:ToinvestigatetheimmunologiccharacteristicsandcytotoxicityoftheRetroNectin-activatedcytokine-inducedkillercells(CIK)againstdrug-resistantlungcancercelllinesDDP-A549(DDP:Cisplatin).Peripheralbloodmononuclearcells(PBMC)werecollectedfromhealthydonorsanddividedintotwogroups:groupIandgroupII.SeededsamplesofgroupIintocultureflaskprecoatedwithRetroNectinandCD3MAbtoinducetheCIKcellswhileseededthegroupIIintocultureflaskprecoatedwithCD3MAb.Inbothgroups,IFN-γwasputintotheflaskonthesamedayandthenIL-2onthesecondday.TheproliferationofCIKcellswastestedbycytometircanalysis.ThecytotoxicityactivityofCIKcellswasdeterminedbyMTTassays.ThephenotypechangesofCIKcellswereidentifiedbyflowcytometricanalysis.Scanningelectronmicroscope(SEM)andtransmissionelectronmicroscope(TEM)wereusedtoviewthecytotoxicityagainstDDP-A549ofCIKcellsandthechangesofDDP-A549.ThetotalCIKcellssignificantlyincreasedby524.77foldincellproliferationnumberduetotheactivationtoCIKcellsofRetroNectin.The1374ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechAugust25,2008Vol.24No.8Journals.im.ac.cnexpressionrateofCD3+CD56+cellswas(31.40±1.91)%.ThecytotoxicityofCIKcellsshowedstatisticallysignificancebetweenDDP-A549andthesensitivestrainsofparentalgenerationA549(P0.01).TherewasnosignificantdifferenceofCIKcells’cytotoxicitybetweentwogroupswhentheeffector:targetratiowasfixed(P0.05).RetroNectincansignificantlyimprovetheproliferationactivityofCIKcells.TherewasnoevidentinfluencetothecytotoxicityofCIKcells.CIKcellsmaybeusedastheimmuotherapytolungadenocarcinomaowingtoitssignificantinhibitiontotheproliferationofDDP-A549.Keywords:cytokine-inducedkillercell,RetroNectin,proliferation,lungcarcinomacell,cytotoxicityactivity1991年,斯坦福大学Schmidt-Wolf等首先报道了一种在多种细胞因子共同作用下培养出的具有细胞毒活性的杀伤细胞,即细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkiller,CIK),它比LAK细胞具有更强大的肿瘤杀伤活性[1−3]。近来,有研究报道重组人纤维蛋白片段(RetroNectin)﹑﹑可参与细胞的附着伸展分化和增殖。该产品已注册美国药典和国际专利。本研究拟观察RetroNectin对CIK细胞的增殖辅助作用,以便缩短CIK细胞的培养周期,以最大限度地获取临床所需的输入数量;并观察此种方法诱导出的CIK的免疫学特性和对肺癌耐药细胞DDP-A549的杀伤作用。1材料和方法1.1材料干扰素(IFN-γ)为美国Peprotech公司产品,RetroNectin﹑GT-T503培养基(人淋巴细胞培养基)及GT-T603培养袋均为北京宝日医生物技术有限公司产品,CD3MAb购于北京宝日医生物技术有限公司,由古巴分子免疫学中心研制生产。IL-2购自江苏金丝利药业有限公司,鼠抗人CD3-Percp/CD4-FITC/CD8-PE和CD3-FITC/CD56-PE及同亚型对照抗体兔抗鼠IgG1均为美国BD公司产品,胎牛血清为杭州四季青生物责任有限公司产品,RPMI-1640干粉为美国GibcoBRL产品,顺铂(DDP)购自科鼎医疗有限公司。健康人外周血由哈尔滨红十字中心血站提供,淋巴细胞分离液为天津市灏洋生物制品科技有限责任公司产品,MTT为北京索莱宝科技有限公司产品,流式细胞仪为美国BD公司产品,酶标分光光度计为BioRAU,450型,美国制造。荧光倒置显微镜为日本OLYMPUS公司产品。1.2靶细胞人肺腺癌耐DDP细胞株A549/DDP受赠予研究所(购于湖南省万佰生物有限公司),耐药倍数为24.44;A549肺腺癌细胞为哈尔滨医科大学肿瘤研究所保留株。1.3方法1.3.1CIK细胞的诱导将RetroNectin10μg/mL与CD3MAb5μg/mL加入10mLpH7.2~7.4PBS中,另一组单独用CD3MAb5μg/mL加入10mLpH7.2~7.4PBS中,4oC,避光,过夜,包被底面积为75cm2的培养瓶。次日,弃包被液,PBS(1次)RPMI(1次)清洗培养瓶。取健康人外周血,经人淋巴细胞分离液密度梯度分离:2000r/min,20min。取中间环状乳白色单核细胞层,用生理盐水反复洗2次(1800r/min,8min;1000r/min,5min),悬浮于GT-T503中,2h后细胞计数,两组均按细胞总数为2×107个接种于培养瓶中用加入6%人血浆的GT-T503淋巴细胞培养基培养,按1000u/mL加IFN-γ,24h后按300u/mL加IL-2。RetroNectin刺激4d后,将2组培养瓶中的细胞完全吹打下来后转移到GT-T603培养袋,(因为贴壁细胞是经过RetroNectin刺激的,所以要尽量吹打干净)。扩充培养基体积至4-6倍,每3天补充新鲜培养液和细胞因子IL-2。CIK细胞从培养第14天开始回收,余分袋培养。1.3.2耐药肿瘤细胞DDP-A549的培养将1×106A549接种在DDP浓度为1μmol/mL的RPMI-1640培养液中,正常换液,培养1周;改DDP浓度为2μmol/mL,培养1周;再改DDP浓度为3μmol/mL,培养1周。以后培养均维持该浓度。收集生长良好的DDP-A549,按常规方法测定其在含3μmol/mLDDP的RPMI-1640中的生长情况,计算倍增时间:Td=T×lg2/(lgN2-lgN1),N1为起始时间细胞数,N2为终止时间细胞数,T为N1到N2的时间(h)。1.3.3光镜下细胞形态观察在诱导过程中每天于光镜下观察CIK细胞形态变化。与肿瘤细胞共同培养,观察两者形态上的差别。任玮等:重组人纤维蛋白片段诱导CIK的增殖及对肺癌耐顺铂细胞的杀伤作用1375Journals.im.ac.cn1.3.4CIK细胞增殖活性的测定用注射器随机抽取培养袋中的CIK细胞1mL,5次,混匀,用胎盘蓝计数细胞总数计算平均值,每3天1次,根据细胞增殖倍数绘制生长曲线。1.3.5CIK细胞毒活性的测定CIK诱导第14天时,取对数生长期的肿瘤细胞,调整细胞浓度分别为1×105/mL、5×104/mL、2.5×104/mL,每孔100μL铺于96孔板中,每组设4个复孔,置37oC,5%CO2孵箱内培养,6h后将浓度调整为1×106/mL的效应细胞CIK按与靶细胞浓度分别为10:1、20:1、40:1加入96孔板中,另设单独靶细胞组(靶细胞+培养液)和单独效应细胞组(效应细胞+培养液)为阴性对照组,作用48h后每孔加入MTT20μL/孔,继续培养4h