重组人胰岛素的体外复性纯化

第３６卷第１期２００９年北京化工大学学报（自然科学版）犑狅狌狉狀犪犾狅犳犅犲犻犼犻狀犵犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔狅犳犆犺犲犿犻犮犪犾犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔（犖犪狋狌狉犪犾犛犮犻犲狀犮犲）犞狅犾．３６，犖狅．１２００９重组人胰岛素的体外复性纯化陈阳陈劲春（北京化工大学生命科学与技术学院，北京１０００２９）摘要：对大肠杆菌表达的重组人胰岛素原包涵体蛋白的变性复性条件进行了优化。考察了变性液中犇犜犜的浓度，复性液的狆犎值，还原型谷胱甘肽（犌犛犎）与氧化型谷胱甘肽（犌犛犛犌）的物质的量比，甘氨酸（犌犾狔）浓度对复性的影响。结果表明，在变性液中加入６０犿犿狅犾／犔犇犜犜，复性液狆犎９５，犌犛犎与犌犛犛犌物质的量比为５∶１，犌犾狔浓度为５０犿犿狅犾／犔条件下复性率最高。复性后的重组人胰岛素原过犇犈犃犈犛犲狆犺犪狉狅狊犲犉犉柱，经过犜犘犆犓胰蛋白酶和羧肽酶犅酶切后，再过犛犲狆犺犪犱犲狓犌２５柱，得到纯度较高的重组人胰岛素。目的蛋白收率为９６犿犵／犵干菌体。关键词：重组人胰岛素原；变性；复性；酶切中图分类号：犙５７８收稿日期：２００８０３２８第一作者：女，１９８２年生，硕士生通讯联系人犈犿犪犻犾：犼犻狀犵犮犺狌狀犮犺犲狀＠犺狅狋犿犪犻犾．犮狅犿引言胰岛素是治疗糖尿病的重要药物。用于临床己有８０多年，过去医用胰岛素都是从猪和牛的胰腺提取，犇犖犃重组技术的出现为胰岛素的生产开创了新的途径［１］。大肠杆菌表达系统在重组人胰岛素的生产中已显示出了它的优越性，国内外已展开了广泛的研究和应用，尤其是对大肠杆菌表达策略的研究越来越多［２３］，从不同角度改进和完善了胰岛素的大肠杆菌表达系统。另外由于大肠杆菌表达的融合蛋白往往以包涵体的形式表达，表达的产物必须经过复性和纯化才能得到具有生物活性的产物，往往复性效率很低，降低了胰岛素的最终收率。变性蛋白在复性过程中由于二硫键的错配会形成许多异构物和多聚体，可以通过加入氧化还原试剂将错配的二硫键还原后重新氧化，恢复正确构象，复性体系中的狆犎和二硫苏糖醇（犇犜犜）、还原型谷胱甘肽（犌犛犎）、氧化型谷胱甘肽（犌犛犛犌）以及甘氨酸（犌犾狔）的添加对复性结果也有一定的影响［４６］。本文主要研究了不同变性复性条件对重组人胰岛素原复性效率的影响，选择最佳变性复性工艺。最终得到的重组人胰岛素可以达到９６犿犵／犵干菌体，收率明显高于以往的文献报道［７］。１材料和方法１１菌种狆犈犜２８（＋）犪犈．犮狅犾犻犚狅狊犲狋狋犪菌株由本实验室构建并保存。１２实验试剂及仪器犌犛犎、犌犛犛犌、犌犾狔，欣经科公司；羧肽酶犅，犛犻犵犿犪公司；犜犘犆犓胰蛋白酶，上海国源生物技术有限公司；其余试剂为国产分析纯。犜犌犔１６犌台式离心机、犌犔２０犌Ⅱ冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；犑犢９８３犇超声波细胞破碎仪，宁波新芝科器研究所；犇犈犃犈犛犲狆犺犪狉狅狊犲犉犉，北京欣经科生物技术有限公司；犛犲狆犺犪犱犲狓犌２５，犘犺犪狉犿犪犮犻犪公司；液相色谱仪（包括犔犆１０犃犜泵，犆犜犗１０犃柱温箱，犛犘犇１０犃检测器，色谱数据处理软件），日本岛津公司。１３基因工程菌的诱导表达将大肠杆菌基因工程菌接种于犔犅培养基中，３７℃，１６０狉／犿犻狀培养过夜，转接到２×犢犜培养基中，３７℃，１６０狉／犿犻狀振荡培养２犺，加入犐犘犜犌诱导６～８犺停止发酵，离心收集菌体。培养基配方见文献［８］。１４包涵体的收集与洗涤菌体细胞用细胞洗液（１００犿犿狅犾／犔犜狉犻狊犎犆犾，１０犿犿狅犾／犔犈犇犜犃，１００犿犿狅犾／犔犖犪犆犾，狆犎８０）洗涤２次。超声破碎，５狊×５０次，间隔１０狊，超声功率６００犠。４℃离心弃上清，用含有２犿狅犾／犔尿素和１００犿犿狅犾／犔犜狉犻狊犎犆犾的包涵体洗液洗涤包涵３次。水洗１次。犛犇犛犘犃犌犈电泳分析。１５融合蛋白的体外变性与犆犖犅狉裂解洗涤后的包涵体用含有不同浓度犇犜犜的变性液（６犿狅犾／犔盐酸胍，３０犿犿狅犾／犔犜狉犻狊犎犆犾）溶解。变性液用甲酸调节至狆犎至１５～１７，用７０％乙酸溶解犆犖犅狉，与变性液混合，搅拌２４犺，于阳光下通风，除去未分解的犆犖犅狉，调节变性液至狆犎８左右。１６融合蛋白的复性配制犌犛犎与犌犛犛犌物质的量比不同的复性缓冲液，分别调节为不同的狆犎值。采用脉冲稀释法复性，将变性液每隔３０犿犻狀分５次加入到复性缓冲液中，变性液与复性液体积比为１∶１０，放置２４犺。在研究狆犎对复性影响效果的同时分别添加不同浓度的犌犾狔研究其对复性的影响。重复实验３次。１７重组人胰岛素原的纯化收集折叠正确的重组人胰岛素原，用狆犎８的犜狉犻狊缓冲液透析平衡，再转到狆犎值６５的磷酸缓冲体系中。犇犈犃犈犛犲狆犺犪狉狅狊犲犉犉柱用狆犎值６５的犘犅犛缓冲液平衡，复性液上柱，用合适的犖犪犆犾梯度进行洗脱，紫外检测仪在线检测，收集２８０狀犿吸收峰。１８酶切转化及重组人胰岛素的纯化将纯化得到的重组人胰岛素原用犜犘犆犓胰蛋白酶酶切３０℃，１犺。１０％犜犉犃终止反应。再加入羧肽酶犅，３７℃，酶切３０犿犻狀。将重组人胰岛素粗品过犛犲狆犺犪犱犲狓犌２５柱［９］，层析柱的平衡液和洗脱液均为狆犎７的５犿犿狅犾／犔的磷酸缓冲液，２８０狀犿，收集峰，犛犇犛犘犃犌犈电泳分析，犎犘犔犆分析。２结果与讨论２１包涵体的犛犇犛犘犃犌犈电泳分析收集得到包涵体３４犵，犛犇犛犘犃犌犈电泳图谱如图１所示，１４０００处有目的蛋白条带，与理论值相符。经过３次洗涤的包涵体，杂蛋白明显减少，目的蛋白占包涵体蛋白中的７０％以上，说明包涵体洗涤中的尿素将部分杂蛋白溶解，３次洗涤对目的蛋白的纯化也起到粗分的作用，再增加洗涤的次数，会造成目的蛋白的洗涤损失。２２犇犜犜浓度对复性的影响将加入不同浓度犇犜犜的犆犖犅狉切后变性液用犎犘犔犆分析如图２所示，可以看出，峰１是杂蛋白和折叠错误的蛋白，峰２是折叠正确的重组人胰岛素原单体，随着犇犜犜浓度的增加，正确折叠的重组人胰岛素原单体明显增加，在总蛋白中的比例也增大，说明犇犜犜的加入有助于包涵体的重折叠。故选用含有６０犿犿狅犾／犔犇犜犜的变性液溶解包涵体。犃—基因工程菌加入诱导剂前全菌蛋白；犅—基因工程菌诱导后全菌蛋白；犆—标准蛋白质；犇—洗涤后的包涵体图１基因工程菌与包涵体的犛犇犛犘犃犌犈电泳分析犉犻犵．１犛犇犛犘犃犌犈犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊犳狅狉犵犲狀犲犲狀犵犻狀犲犲狉犻狀犵犫犪犮狋犲狉犻犪犪狀犱犻狀犮犾狌狊犻狅狀犫狅犱狔图２犇犜犜对蛋白质折叠影响的犎犘犔犆分析犉犻犵．２犎犘犔犆狋狉犪犮犲狊狊犺狅狑犻狀犵狋犺犲犲犳犳犲犮狋狅犳犇犜犜狅狀狆狉狅狋犲犻狀犳狅犾犱犻狀犵·８７·北京化工大学学报（自然科学版）２００９年２３重组人胰岛素原复性的影响条件在蛋白质量浓度为０４～０８犿犵／犿犔条件下复性时，蛋白很少聚集，且复性率较高，故复性操作均控制蛋白浓度在该范围内。２３１狆犎值及犌犛犎与犌犛犛犌物质的量比对复性的影响狆犎值在７０以上，可以防止自由硫醇的质子化作用影响正确配对的二硫键的形成，过高过低都会降低复性率。复性液中氧化还原系统对蛋白质的复性具有较大的影响。氧化性试剂能够促进二硫键的形成，而还原剂能够催化错误配对的二硫键进行重排，其浓度和比例应该有合适的范围。才能有助提高目的蛋白的正确折叠率。在基础复性液（１００犿犿狅犾／犔犜狉犻狊犎犆犾，１犿狅犾／犔尿素）中犌犛犛犌浓度固定为０３犿狅犾／犔，改变复性液中犌犛犎与犌犛犛犌物质的量比为２∶１，５∶１，１０∶１，改变狆犎值７５，８０，８５，９０，９５。犎犘犔犆分析正确折叠的重组人胰岛素原含量，平均３次实验结果，如图３所示，当狆犎为９５，狀（犌犛犎）／狀（犌犛犛犌）为１０∶１与５∶１差别不太大，考虑成本问题，故选用狆犎为９５，狀（犌犛犎）／狀（犌犛犛犌）为５∶１，即犌犛犎浓度为１５犿犿狅犾／犔，犌犛犛犌为０３犿犿狅犾／犔。图３狆犎值及犌犛犎与犌犛犛犌物质的量比对复性的影响犉犻犵．３犐狀犳犾狌犲狀犮犲狅犳狆犎犪狀犱狋犺犲狉犪狋犻狅狅犳犌犛犎狋狅犌犛犛犌狅狀狉犲狀犪狋狌狉犪狋犻狅狀２３２犌犾狔浓度对复性的影响当复性液中加入适量的犌犾狔时，可明显提高复性率，原因在于犌犾狔的加入有助于增加复性中间产物的溶解度。３次实验结果表明，当复性液中狀（犌犛犎）∶狀（犌犛犛犌）为５∶１，加入适量的犌犾狔时，复性过程中不会形成肉眼可见的沉淀，且正确折叠的重组人胰岛素原含量明显增高。从图４可以看出，当狆犎为９５，犌犾狔浓度为５０犿犿狅犾／犔时，重组人胰岛素原的复性率最高，可达到７０％以上。图４犌犾狔浓度对复性的影响犉犻犵．４犈犳犳犲犮狋狅犳犌犾狔犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狅狀狉犲狀犪狋狌狉犪狋犻狅狀２４重组人胰岛素原的纯化及酶切复性液用犇犈犃犈犛犲狆犺犪狉狅狊犲犉犉柱分离，犖犪犆犾浓度００５犿狅犾／犔可以洗脱下一些杂蛋白，在０１犿狅犾／犔时，有分子量６０００左右的两条带被洗脱下来，此条带即为目的蛋白。将收集的目的蛋白透析冷干，干燥后的粉末溶于犜狉犻狊犎犆犾缓冲液，狆犎７５。按照酶与蛋白质量比１∶５００加入犜犘犆犓胰蛋白酶，３０℃，酶切１犺。１０％犜犉犃终止反应。按照酶与蛋白质量比１∶１０００加入羧肽酶犅，３７℃酶切３０犿犻狀。犛犇犛犘犃犌犈电泳如图５所示，经过犜犘犆犓胰蛋白酶和羧肽酶犅酶切后得到的重组人胰岛素与人胰岛素标准品位置平行，分子量５８００左右。先在３０℃条件下酶解是为了降低犜犘犆犓胰蛋酶的活性，以免切掉部分氨基酸序列。本实验中所选用的酶切条件准确有效地将重组人胰岛素原转化为重组人胰岛素。犃—重组人胰岛素原；犅—酶切后重组人胰岛素；犆—重组人胰岛素标准品；犇—标准蛋白质图５酶切后犛犇犛犘犃犌犈电泳分析犉犻犵．５犛犇犛犘犃犌犈犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊犪犳狋犲狉犮犾犲犪狏犪犵犲·９７·第１期陈阳等：重组人胰岛素的体外复性纯化２５胰岛素的纯化经过犛犲狆犺犪犱犲狓犌２５柱的分离纯化，收集的第一个峰即为胰岛素，犎犘犔犆分析结果如图６显示，保留时间１４２５３犿犻狀，与标准品保留时间１４３９０犿犻狀基本一致。以优化的最佳变性复性条件进行３次重复实验，３次得率分别为９７４４，９５５９，１００２０犿犵／犵干菌体。可以看出，优化后复性率和收率大幅提高。犪—人胰岛素标准品；犫—犛犲狆犺犪犱犲狓犌２５柱纯化后的重组人胰岛素图６重组人胰岛素犎犘犔犆分析犉犻犵．６犎犘犔犆犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狉犲犮狅犿犫犻狀犪狀狋犺狌犿犪狀犻狀狊狌犾犻狀３结论变性液中加入６０犿犿狅犾／犔犇犜犜，复性液狆犎９５，犌犛犎与犌犛犛犌物质的量比为５∶１，犌犾狔浓度为５０犿犿狅犾／犔条件下，重组人胰岛素原的复性率达到７０％以上，经过犜犘犆犓胰蛋白酶和羧肽酶犅酶切后得到胰岛素最终收率达９６犿犵／犵干菌体。参考文献：［１］犉狉狅狊狋犜，犚犪狏犲犓，犘犳狌犲狋狕狀犲狉犃，犲狋犪犾．犈犳犳犲犮狋狊狅犳犆狆犲狆狋犻犱犲狅狀犵犾狌犮狅狊犲犿犲狋犪犫狅犾犻狊犿犻狀狆犪狋犻犲狀狋狊狑犻狋犺狋狔狆犲１犱犻犪犫犲狋犲狊［犑］．犇犻犪犫犲狋犲狊犆犪狉犲，２００２，２５（６）：１０９６－１０９７．［２］犜犪狀犵犑犌，犎狌犕犎．犘狉狅犱狌犮狋犻狅狀狅犳犺狌犿犪狀狆狉狅犻狀狊狌犾犻狀犻狀犈．犮狅犾犻犻狀犪狀狅狀犳狌狊犻狅狀犳狅狉犿［犑］