《分子育种》PPT课件

第7章分子育种基因工程育种原理定向进化理性设计非理性设计2本章重点基因工程育种的主要步骤定向进化定点突变DNA重排基因组重排3本章难点各种载体的结构和特点含重组质粒的细菌菌落的鉴定基因定点突变DNA重排基因组重排4第五节定向进化定向进化（directedevolution）是指在试管中进行的“分子进化”，也即在实验室人工控制的条件下模拟和加速生物分子向特定目标进化的过程。其对象可以是蛋白质或多肽，也可以核酸和其他大分子，甚至是一些生物体中的小分子。它通过人工合成或借助于重组DNA技术，人为制造大量的变异体，然后按照特定的需要和目的，给予选择压力，或通过高通量筛选技术，将满足特定目的的分子筛选出来，从而实现试管中分子水平上的模拟进化。5定向进化是一个由构建突变体库，突变体表达，表达后筛选三个步骤组成的循环递进过程，需要：产生包含大量带有微量有利突变的突变体的文库;突变体应能在适当的微生物（如大肠杆菌或酵母菌）体内进行功能的表达;必须有一种灵敏的筛选方法，能反映出由一个氨基酸的置换而引起的预期性状的较小提高。9变异库的产生和筛选说明：colorometric比色法；fluorescent荧光法；chemiluminescent化学发光法；biotransformation生物转化；screen筛选10酶的定向进化通过定点突变等基因改造技术，改变蛋白序列中的个别氨基酸残基，可以对酶的性质和其催化特性进行改造，产生符合特定需要的酶，这一蛋白质工程技术又称为分子进化的理性设计。这一技术使人们避开了对酶的构效关系的研究这一难题，并成功地用于酶的稳定性、底物特异性、立体选择性等酶的催化特性和酶的催化能力的改进。11定向进化不仅是一个酶分子改造的良好工具，也是探索和研究酶蛋白构效关系的良好工具。随着各种基因技术的应用和发展，产生包含大量带有微量有利突变的突变体的文库，已经不再是一个技术难题，当前的主要研究方向是更有效的突变技术和构建更简洁的突变体库的技术。12突变体的筛选技术仍然是主要技术瓶颈，当前除了要继续发展各种结合酶催化功能的高通量筛选技术，还要进一步完善各种与重组表达技术相结合的蛋白筛选技术和蛋白展示库技术。对一些无明显表型突变体的筛选需要更多的研究与重视。13人们已经利用定向进化方法成功实现对许多蛋白质分子的改造。如提高T4溶菌酶和酵母磷酸丙糖异构酶的热稳定性，改变枯草杆菌蛋白酶的Km和Kcat值，改变丝氨酸蛋白酶的最适pH值，提高酪氨酰-tRNA合成酶的活性，改善葡萄球菌核酸酶的特异性等。14定向进化技术包括：定点突变（定点的）易错PCR（随机的）DNA重排（重组的）……15一、定点突变重组DNA技术不仅可以将外源基因导入受体菌构建新的工程菌，以表达目的产物，还可以用来对目的基因进行体外定向诱变，将目的基因按人们所希望的目标加以改造。基因体外定向诱变的基本方法是先克隆待诱变的目的DNA片段，并将它与载体重组，然后在体外对环状重组体进行定点突变，再将诱变后的DNA片段导入受体细胞使其表达目标产物。1617LipasesEsterasesthathydrolyzetriglyceridesatawater/oilboundaryUsesDegradationoffoodandfatDrugsforthetreatmentofdigestivedisordersanddiseasesofthepancreasDetergentadditivesOrganicSynthesisAcceptawiderangeofsubstratesStableinnon-aqueoussolventsEstersynthesisorhydrolysis(ΔG~0kcal/mol)说明：lipase脂肪酶，esterase酯酶，triglyceride三甘油酯，Degradation降解，Detergentadditives洗涤剂添加剂，hydrolysis水解18LipasesKineticResolutionsofChiralAlcoholsandAcids“Kazlauskas’Rules”MLHOHMLHHOMLHO2CH说明：KineticResolutions动力学拆分，Chiral手性的，L-menthol薄荷醇，Enalapril依那普利，(ACEinhibitor血管收缩转化酶抑制剂，Diltiazem地尔硫卓，(S)-naproxen萘普生，Flurbiprofen氟比洛芬C6H13COORMeC6H5OHMeR=C20H42,C12H2642%Conversion,97%ee45%Conversion,97%eeIndustrialApplicationsL-mentholEnalapril(ACEinhibitor)Diltiazem(S)-naproxenFlurbiprofen19IncreasingEnantioselectivityRationalDesignCandidaantarcticalipaseB(CALB)OxyanionHoleRemovestabilizinginteractionofthreonine40withsubstrateTwomutants–Thr40Val,Thr40AlaSubstrate-assistedcatalysis说明：Enantioselectivity对映选择性，OxyanionHole氧负离子孔洞，Candidaantarctica南极假丝酵母ΔG‡increasedby15-19kJ/molDecreasedkcat20IncreasingEnantioselectivityRationalDesignSelectivityFactor,EHigherE,Greater%eeWild-typeCALB,E=1.6Thr40AlaCALB,E=9.8Thr40ValCALB,E=22Magnusson,A.;Hult,K.;Holmquist,M.J.Am.Chem.Soc.2001,123,4354E=(kcat/Km)a(kcat/Km)b=ln[(1-U)(1+eeproduct)]ln[(1-U)(1-eeproduct)]OHOOCALBH2OOHOHOHO+OHOOCALBH2OOHOHOHO+21一、定点突变方法（具体）基因体外定点突变的方法有：删除法插入法取代法不完全适配的低聚核苷酸介导法22（一）删除法在目的基因中删除一个或若干个碱基序列，使基因发生重排而造成其性状的改变。基本操作方法：先克隆目的基因DNA片段，然后用酶切除DNA片段中的碱基序列，把保留的序列连接起来后，再导入受体细胞进行表达。2324地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶具有脂蛋白的形式，它以肽链中的半胱氨酸27与膜类脂的甘油酯以硫醚键相连成为酶分泌过程中的中间产物。β-内酰胺酶基因进行定向删除后，使基因产物缺失了5个氨基酸，包括半胱氨酸27，结果脂蛋白中间产物不再出现，但酶的催化活性和分泌性都不受影响。25（二）插入法插入法即在目的基因中插入单个或多个核苷酸序列，使原基因序列发生改变进而改变基因产物。比较常用的插入方法是对待处理的DNA序列环状分子在适当的位点进行单处切割，使出现粘性位点，然后用Klenow片段处理样品，在dNTP和Mg2+的存在下，单链尾巴会被补链成为双链，原来的粘性末端成了平头端，环化后再导入受体细胞。2627（三）取代法取代法是将目的DNA中的某个碱基进行置换，使置换处编码的氨基酸发生改变。DNA中碱基的置换可以通过“点诱变”来实现。根据不同的诱变要求，点诱变可以有以下情况：特定的G:C变A:T错配取代281．特定的G:C变A:T第一步：开创DNA单链区第二步：G:C变A:T29(1)开创DNA单链区点诱变要在DNA单链上进行。首先在双链的目的DNA分子上某个限制酶切点附近开创出一小段单链区域。常用的方法有两种：一是先用溴化乙锭与DNA结合，再用限制酶切开一个裂口（gap），双链DNA中一条链仍保持完整。而后可用核酸酶ExoIII来开创出一个单链区域。另一种方法是利用DNA聚合酶沿着3'-5’的方向降解带有裂口的那条链。30（2）G:C变A:T单链DNA上的胞嘧啶被酸式亚硫酸离子作用后反应脱氨基而变成尿嘧啶（CU），而双链部分的C则不发生变化。当把单链区域修补成双链时，A将与U配对，此时U相应于T,结果原来的G:C变成了A:T。312．错配取代这种方法的原理是：当大肠杆菌DNA聚合酶或T4聚合酶对DNA分子的单链部分补链时，反应体系中如果只有四种核苷酸底物的三种，在正常情况下，新链的合成将会停止在所缺的那种核苷酸应该结合的位置之前。但在偶然情况下，DNA聚合酶会把所存在于反应体系中的某一种核苷酸错误地接在所缺的那种核苷酸应该结合的位置上，这样就可能造成取代作用。为了防止出现自动修正作用，可用α-硫代三磷酸核苷作为底物，这种类似物不为酶所识别和纠正。3233（四）不完全配对的低聚核苷酸介导法以上的碱基取代都是在双链DNA分子的某个单链区域进行的。在双链DNA上要利用限制酶来切开一个单链裂口，这就意味着所发生的取代只能在限制酶切点的附近，这种空间的限制作用使上述方法具有一定的局限性。利用不完全配对的低聚核苷酸介导法可以克服上述局限性。34这种方法的具体操作是：在进行DNA处理前，先测定DNA的序列，根据诱变点附近的碱基排列顺序合成一段13个碱基左右的低聚核苷酸片段，低聚核苷酸与待诱变位点不配对但与诱变点两侧完全配对。将DNA分子克隆在噬菌体M13载体上变为单链后，与低聚核苷酸片段相混合，使该片段与DNA的相应部分发生“退火粘合”。补链后的双链DNA分子导入细胞后，经过第二轮复制，误配分子产生出野生型子代和变异型子代。35•Oligonucleotide-directed,site-specificmutagenesis•寡聚核苷酸介导的定点突变36(continued)37Invitrosite-specificmutagenesis50%WT50%mutantM13=singlestrandedbacteriophage38理论上，如果含突变的DNA链和正常的DNA链复制速率相同，应该有50%的克隆带突变基因。但是，由于许多技术上的原因，实际上一般只有1%～5%的克隆带突变基因。显然，这样的效率还不尽如人意。此后，研究者又设计出很多方法以提高定点突变的频率，其中比较常用的Kunkel提出的一种配合该技术的诱变体产量富集法。39这种方法用具dut和ung基因缺陷的大肠杆菌制备M13载体。dut基因编码催化dUTP分解的dUTPase，该基因缺陷会使细胞中dUTP含量升高，导致复制时少量dUTP代替dTTP掺入DNA。ung基因编码尿嘧啶DNA糖基化酶，该基因缺失后，不能除去掺入DNA的dUTP。40因此，利用dut–ung-菌株制备的M13载体中，大约1%的T被U取代。以这样制备的M13(+)链为模板进行寡核苷酸介导的定点突变，然后将得到的双链DNA转化到dut+ung+菌株中，最初的含UU的模板会被降解，而突变链则因不含U被复制。这样，带有定点突变基因的噬菌体比例可显著提高。41EnzymethatremovesUfromU-containingDNAApyrimidinicDNAformedandwillnotreplicateGetridofWTgenome:MutantE.coliallowsUtopersistinDNA42二、易错PCR用热稳定DNA聚合酶扩增目的DNA时，会以一定的频率发生碱基错配。这对高保真要求的DNA扩增来说当然是不利的，但这一现象恰好也提供了一种对特定基因进行随机褥变的可能方法。这种利用PCR过程中出现的碱基错配进行特定基因进行随