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重组DNA技术刘新文北京大学医学部生物化学与分子生物学系刘新文，重组DNA技术第一节概述DNA克隆(DNAcloning)：应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子—复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子的过程。DNA克隆又称基因克隆（genecloning）。基因工程（geneticengineering）：实现基因克隆所采用的方法及相关的工作。又称重组DNA技术（recombinantDNAtechnology）刘新文，重组DNA技术一、克隆体系：目的基因、载体DNA、工具酶、宿主细胞等1、目的基因（targetgene）：cDNA或基因组DNA2、载体(vector)：质粒、噬菌体、柯斯质粒载体、病毒和人工染色体等cDNA（complementaryDNA）：指体外经反转录合成的，与RNA（常指mRNA）互补的单链DNA,单链cDNA进而合成双链cDNA。基因组DNA（genomicDNA）：代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列，称为基因组DNA。刘新文，重组DNA技术质粒（plasmid）：存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，在细胞中可以独立进行复制并在细胞分裂时恒定地传给子代细胞。3.1限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease):存在于细菌体内，能够识别和切割双链DNA内部特定核苷酸序列的一类核酸酶。3、工具酶：限制性核酸内切酶、连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶、碱性磷酸酶、末端聚合酶、RNA酶、DNA酶，等常用的是II类限制性内切酶许多限制性核酸内切酶II的识别序列属于回文结构刘新文，重组DNA技术配伍末端（compatibleend）：不同限制性内切酶产生的相同粘性末端3.2DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶）、Klenow片段(Klenow酶)、T4DNA聚合酶以及Taq酶等3.3DNA连接酶T4连接酶：可用于粘端与平端的连接4、宿主细胞：大肠杆菌、酵母、动物细胞刘新文，重组DNA技术第二节DNA克隆的基本过程分、切、接、转、筛、表达一、“分”：目的基因及载体的制备1、分离基因的方法：化学合成、PCR、基因组文库、cDNA文库聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）：在反应体系中加入模板DNA、dNTP、特别设计的特异引物及耐热的DNA聚合酶（常用Taq酶），经多次变性、退火、延伸循环反应，使目的DNA呈指数合成的过程刘新文，重组DNA技术cDNA文库(cDNAlibrary)：以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有cDNA信息，总称cDNA文库。常用于筛选编码蛋白质的结构基因。基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)：利用限制性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有基因组DNA信息，总称基因组DNA文库刘新文，重组DNA技术2、常用载体：质粒、噬菌体、病毒DNA克隆载体（cloningvector）：用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点突变等表达载体(expressionvector)：用于在宿主细胞中表达外源目的基因，获得大量表达产物二、“切”：限制性内切酶切割目的基因和载体DNA三、“接”：重组体的构建四、“转”：重组DNA分子导入受体细胞1、转化（transformation）：将质粒或其它外源DNA导入宿主细胞(常用大肠杆菌)，并使其获得新的表型的过程刘新文，重组DNA技术2、转染（transfection）：将外源DNA导入真核细胞的过程3、感染（transfection）：以l噬菌体、柯斯质粒和病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。也称为转导（transduction）五、“筛”：筛选出含重组DNA的受体细胞1、直接选择法：遗传标记【抗药性标志选择、营养缺陷型的互补筛选法及分子标记（PCR、分子杂交）】2、非直接选择法：免疫化学法、酶联免疫检测法刘新文，重组DNA技术六、“表达”：使克隆基因在宿主细胞中复制、表达1、外源基因在原核细胞的表达大肠杆菌是最常用的原核表达体系真核基因在原核细胞中表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体2、真核表达体系：酵母、昆虫及哺乳动物细胞等刘新文，重组DNA技术第三节重组DNA技术与分子医学的关系疾病基因的发现、发展新药物、DNA诊断、基因治疗及遗传病的防治一、疾病相关基因分析1、功能克隆（functionalcloning）：根据基因的功能（通常是根据其蛋白质）产物来寻找、克隆与疾病相关的基因2、定位克隆（positionalcloning）：从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因二、制造生物活性蛋白刘新文，重组DNA技术三、基因诊断基因诊断：利用分子生物学的基本原理和技术，在DNA或RNA水平上分析、鉴定与某些疾病有关基因的改变（基因结构及其表达水平的异常）遗传病的产前诊断、感染性疾病的快速诊断、某些肿瘤的早期诊断以及器官移植供体的选择和法医学鉴定等四、基因治疗基因治疗（genetherapy）：将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，从而达到治疗疾病目的的方法刘新文，重组DNA技术1、基因治疗的方法（分类）（1）基因矫正（genecorrection）：将致病基因的异常碱基进行纠正，而保留正常部分（2）基因置换（genereplacement）：正常基因通过同源重组，原位置换疾病基因（3）基因增补（geneaugmentation）：正常基因非定点整合，补偿疾病基因的功能或使原有功能加强（4）基因失活（geneinactivation）：采用各种方式抑制或破坏某种基因的表达，如反义RNA和RNA干扰(RNAi)技术、核酶与三链DNA、基因敲除（geneknock-out）等刘新文，重组DNA技术概述1973，Cohen等人首次使用DNA克隆技术成功一、克隆与克隆化克隆即指同一副本或拷贝（copy）的集合；获取同一拷贝的过程叫克隆化。【实例】肝组织分离肝实质细胞单一肝实质细胞繁殖----------细胞克隆自众多分子中分离获得相同分子，即为分子可隆，在分子生物学和遗传学领域所谈的分子可隆专指DNA可隆.刘新文，重组DNA技术一、质粒的特点：1、环状DNA，2kb～数百kb。2、某些质粒可以重组到染色体中复制，形成附加体。质粒载体3、质粒的遗传信息可以赋予细胞某些性状（抗药性等），这些形状的有无常用于鉴定质粒是否存在于活细胞中。4、质粒复制分两型——严谨型、松弛型刘新文，重组DNA技术松弛控制性质粒，拷贝数多，不受细胞内染色体控制。5、质粒含易位子和易位现象。易位子是质粒上的特定DNA序列，它可以从所在质粒易位于其它质粒或染色体中，它对细菌的进化有意义。质粒载体严谨控制型质粒，拷贝数少，复制受染色体控制。刘新文，重组DNA技术质粒载体理想载体的条件：1、具有自主复制能力；2、具有较多的拷贝数，易与宿主细胞的染色体DNA分开；3、分子量相对较小，能够容纳目的基因；4、具有较多单一限制性内切酶位点；5、有一个或多个筛选标记；6、具有较高的遗传稳定性。刘新文，重组DNA技术TheconstructedplasmidpBR322质粒载体外源基因插入位点EcoRⅠ含一个复制起始点（ori）抗药基因terr和ampr1977年由Boliver等人自E.coli的天然质粒建成。1、克隆载体刘新文，重组DNA技术AnexampleofanE.coliexpressionvector.质粒载体2、表达载体外源基因插入位点复制起始点（ori）标记基因启动子调控序列核蛋白体结合序列刘新文，重组DNA技术噬菌体载体常用噬菌体：l噬菌体载体、M13噬菌体1、l噬菌体载体（1）结构：线性双链DNA，由三个片段组成（左臂、中央、右臂）；感染细菌后，可以形成封闭环分子。（2）两类载体置换型载体：适于基因组DNA克隆。插入型载体：适于cDNA克隆。刘新文，重组DNA技术其它类型载体一、柯斯质粒（cosmid）二、逆转录病毒载体三、Ti质粒可重组45kb的大片段适用于动物细胞的基因工程用于植物细胞基因工程刘新文，重组DNA技术其它类型载体四、酵母人工染色体（YAC）刘新文，重组DNA技术一、限制----修复体系（restriction-modificationsystem）在细菌中与限制性内切酶同时共存有一种甲基化酶，两种酶共同构成细菌的限制--修饰体系内切酶：切除限制外源DNA甲基化酶：保护自身DNA限制性核酸内切酶刘新文，重组DNA技术二、限制性内切酶分类：依据酶的组成、所需辅助因子及裂介方式分为三类1、三个亚基组成的限制酶即有内切酶又有甲基化酶活性需ATP供能辅助因子：Mg2+,S腺苷甲硫氨酸切割：特异性差，切割识别位点约400-700bp或更远的DNA。限制性核酸内切酶刘新文，重组DNA技术限制性核酸内切酶即有内切酶又有甲基化酶活性需ATP供能辅助因子：Mg2+切割：识别位点周围25-27bp内2、两个亚基组成的限制酶3、一个亚基的限制酶：常称作限制性内切酶只有内切酶活性，无甲基化酶活性不需ATP供能辅助因子：Mg2+切割：特异位点内刘新文，重组DNA技术酶识别序列结构呈二元旋转对称又叫作回文结构(palindrome)限制性核酸内切酶【经典举例】EcoRI5’端---GAATTC---3’端3’端---CTTAAG---5’端刘新文，重组DNA技术TheinteractionofEcoRIendo-nucleasewithitstargetsequence.Thedimericenzyme(withitstwosubunitsingrayandlightblue)isshownboundtoDNA.InthetopviewtheDNAbindingsiteisfacingtheviewer.InthebottomviewtheboundDNAisfacingawayfromtheviewerandisnotvisible.限制性核酸内切酶刘新文，重组DNA技术限制性核酸内切酶限制性内切酶切割产物：具有5’磷酸基和3’羟基基团由于酶的作用不同可以产生三种切割末端。（1）5’突出末端：如EcoRI5’端---GAATTC---3’端3’端---CTTAAG---5’端5’AATTC---3’3’G---5’5’---G3’3’---CTTAA5’酶识别DNA序列的长短不同，一般为4-18bp刘新文，重组DNA技术（3）平头钝性末端：如HpaI限制性核酸内切酶5’端---GTTAAC---3’端3’端---CAATTG---5’端5’---GTT3’3’---CAA5’5’AAC---3’3’TTG---5’（2）3’突出末端：如PstI5’端---CTGCAG---3’端3’端---GACGTC---5’端5’---CTGCA3’3’---G5’5’G---3’3’ACGTC---5’刘新文，重组DNA技术工具酶功能限制性内切酶识别特异序列、切割DNADNA连接酶连接DNA片段DNA聚合酶I合成DNA反转录酶合成cDNA多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5末端磷酸化末端转移酶在3羟基末端进行多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基刘新文，重组DNA技术基因工程的基本步骤1、分2、切3、接5、筛4、转6、表达刘新文，重组DNA技术基因工程的基本步骤刘新文，重组DNA技术基因工程的基本步骤刘新文，重组DNA技术基因工程的基本步骤刘新文，重组DNA技术一、化学合成法目的基因的获得对已知基因的核苷酸序列，或蛋白质的氨基酸序列，推导出该多肽编码的核苷酸序列，用DNA合成仪经化学方法合成此基因。【举例】胰岛素原