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1专题五课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段学习目标：1、了解PCR技术的基本操作；2、理解PCR的原理；3、讨论PCR的应用。一、（一）生物体内DNA分子复制的条件1．四种＿＿＿＿＿＿＿是合成子链的原料。2．＿＿＿＿＿＿＿＿提供了DNA复制的模板。3．＿＿＿＿＿＿＿＿打开了DNA双链。4．＿＿＿＿＿＿＿＿催化合成DNA子链。5．＿＿＿＿＿＿＿＿使DNA聚合酶能够从＿＿＿＿＿＿＿的＿＿＿＿＿开始连接脱氧核苷酸。（二）DNA分子复制的有关计算1.一个DNA连续复制n次后，DNA分子总数为：2n2.第n代的DNA分子中，含原DNA母链的有2个，占1/(2n-1)3.若某DNA分子中含某碱基为m，(1)则连续复制n次，所需游离的某碱基（脱氧核苷酸数）为：m×(2n-1)(2)第n次复制时所需游离的某碱基（脱氧核苷酸数）为：m×(2n-1)二、PCR扩增的原理及条件1．概念：PCR即＿＿＿＿＿＿＿＿，是一种＿＿＿＿＿＿迅速＿＿＿＿＿的技术。它能以极少量的＿＿＿＿＿为模板，在短时间内复制出上百万份的＿＿＿＿＿。2．原理（1）DNA的热变性：在＿＿＿＿＿＿的温度范围内，DNA＿＿＿＿＿＿结构解体，＿＿＿＿＿分开，这个过程称为＿＿＿＿＿。当温度缓慢＿＿＿＿＿后，两条彼此＿＿＿＿＿的DNA链又会重新结合成＿＿＿＿＿。（2）子链的合成：①需要＿＿＿＿；②合成方向总是从子链的＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。3．条件（1）＿＿＿＿＿模板。（2）分别与模板DNA＿＿＿＿＿＿相结合的两种＿＿＿＿＿。（3）A、T、G、C四种＿＿＿＿＿＿。（4）＿＿＿＿＿DNA聚合酶，一般用＿＿＿＿＿DNA聚合酶。（5）需要稳定的＿＿＿＿＿和能严格控制＿＿＿＿＿的温控设备。三、PCR反应过程PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为＿＿＿＿＿、＿＿＿＿＿和＿＿＿＿＿三步。1．＿＿＿＿＿：当温度上升到＿＿＿＿＿以上时，双链DNA＿＿＿＿＿为单链。2．＿＿＿＿＿：当温度下降到＿＿＿＿＿左右，＿＿＿＿＿引物通过＿＿＿＿＿与两条单链DNA结合。3．＿＿＿＿＿：温度上升到＿＿＿左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在＿＿＿＿＿的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。四、实验操作1．实验用具（1）PCR仪：该仪器能自动调控＿＿＿＿＿，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用＿＿＿2个＿＿＿＿＿＿代替，操作时按程序在3个＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。（2）微量离心管：总容积为＿＿＿，实际上是进行＿＿＿＿＿的场所。（3）微量移液器：用于＿＿＿＿转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头要＿＿＿。2．操作步骤：准备→＿＿＿＿＿→混合→＿＿＿＿＿→反应。五、操作提示1．为避免＿＿＿＿＿等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行＿＿＿＿。2．所用的＿＿＿和＿＿＿应分装成小份，并在＿＿＿＿储存。3．在＿＿＿＿＿中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的＿＿＿必须＿＿＿。六、DNA含量的测定1．原理：利用DNA在＿＿＿＿＿的紫外线波段的＿＿＿曲线来测定相应含量。2．计算公式：DNA含量（μg/mL）＝50×（＿＿＿的读数）×＿＿＿＿＿＿。【基础达标】1.PCR过程中,引物的作用是()A.打开DNA双链,使DNA解旋为单链B.催化合成DNA子链C.使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始复制D.为DNA复制过程提供模板2.PCR的每次循环都可以分为三步,按循环的顺序排列是()A.变性、延伸、复性B.变性、复性、延伸C.复性、变性、延伸D.延伸、变性、复制3.PCR利用了DNA的热变性原理,PCR仪实际上也是一种能自动调控温度的仪器。下列对PCR过程中“温度的控制”的说法,错误的是()A.PCR反应需要高温,是为了确保模板是单链B.延伸的温度必须高于复性温度,而低于变性温度C.要用耐高温的DNA聚合酶D.需要耐高温的解旋酶4.假设PCR反应中,只有1个DNA的片段作为模板,在5次循环后,反应物中大约有这样的DNA片段的个数是()A.8B.16C.32D.645.下列有关PCR的叙述,不正确的是()A.是一种酶促反应B.引物决定了扩增的特异性C.扩增对象是氨基酸序列D.扩增对象是DNA序列6.关于DNA的复制,下列叙述正确的是()A.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从5′端延伸DNA链B.DNA复制不需要引物C.引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合D.DNA的合成方向总是从子链的3′端向5′端延伸7.下列有关PCR的叙述中正确的是()A.PCR反应所需要的引物只是RNAB.PCR反应所需要的原料是核糖核苷酸C.PCR反应所需要的酶在60℃会变性D.PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行8.在PCR的实验操作中,下列说法正确的是()①PCR所用的缓冲液和酶要在常温下储存;②离心管的盖子一定要盖严;③用手指轻弹离心管壁3④离心的目的是使反应液集中在离心管的底部A.①②③B.①②④C.②③④D.①③④9.下列操作过程的叙述中错误的是()A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌B.PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出之后,迅速融化C.PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份,并在-20℃储存D.在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换10.PCR是一种DNA体外扩增技术,被广泛应用于基因扩增和DNA序列测定等各方面。下图是PCR技术示意图,请回答下列问题:(1)标准的PCR过程一般分为、、三大步骤。(2)引物是此过程中必须加入的物质,从化学本质上说,引物是一小段。(3)将双链DNA,使之变性,从而导致。(4)引物延伸需提供作为原料。【能力提升】1.PCR操作中,从第二轮循环开始扩增的DNA片段()A.固定长度B.一端固定C.都不固定D.不能确定2.复性温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度冷却至40℃～60℃,可使引物和模板发生结合。PCR的结果可不考虑原来解旋开的两个DNA模板链的重新结合,原因不包括()A.由于模板DNA比引物复杂得多B.引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞C.加入引物的量足够多而模板链数量少D.模板链加热解旋已经变性不可能再次结合3.关于PCR技术的应用,错误的一项是()A.古生物学、刑侦破案、DNA序列测定B.诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学C.DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案D.诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定4.在PCR反应中,只有一个DNA的片段作为模板,经过一次循环后,含引物Ⅰ的DNA单链占DNA总链数的()A.1/2B.1/4C.1D.1/85.小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过敏反应,为了克服这个缺陷,可选择性扩增抗体的可变区基因(目的基因)后再重组表达。下列相关叙述正确的是(多选)()A.设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列B.用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列C.PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶4D.一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞6.在进行DNA亲子鉴定时,需大量的DNA。PCR技术(多聚酶链式反应)可以使样品DNA扩增,获得大量DNA克隆分子。该技术的原理是利用DNA的半保留复制,在试管中进行DNA的人工复制(如图,图中黑色长方形是引物)。(1)图中的变性、延伸分别是指、。(2)假设PCR反应中的DNA模板为P,第一轮循环的产物2个子代DNA为N1,第二轮的产物4个子代DNA为N2,N1、N2中分别含有模板DNA单链的DNA分别有个、个。若继续循环,该DNA片段共经过30次循环后能形成个DNA片段。(3)某样品DNA分子中共含3000个碱基对,碱基数量满足AT1GC2，若经5次循环,至少需要向试管中加入个腺嘌呤脱氧核苷酸。(不考虑引物所对应的片段)7、在遗传病及刑事侦破案件中常需要对样品DNA进行分析,其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如下图)，在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。(1)加热使DNA双链打开，这一步是打开键，称为。这一过程在生细胞中是在酶的作用下进行的。(2)当温度降低时，引物与模板末端结合，在酶的作用下，引物沿模板延伸，最终合成两个DNA分子，此过程中原料是，遵循的原则是。(3)PCR技术的必要条件，除了模板、原料、ATP、酶以外，至少还需要三个条件，即液体环境、适宜的和，前者由PCR仪自动调控，后者则靠来维持。(4)通过PCR技术使DNA分子大量复制，若将一个用15N标记的DNA分子放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制4次后，则15N标记的DNA分子占总数的比例为。(5)假设一个模板DNA分子中有800个碱基对，其中含有腺嘌呤600个，若通过PCR技术共消耗周围环境中游离的胞嘧啶脱氧核苷酸6200个，则模板DNA在PCR扩增仪中已经复制了次。(6)PCR反应过程需要DNA解旋，PCR技术利用DNA的原理解决了这个问题。(7)在对样品DNA进行分析的过程中发现DNA掺杂着一些组蛋白，要去除这些组蛋白可加入的物质是。(8)PCR技术不仅为遗传病的诊断带来了便利，而且改进了检测细菌和病毒的方法。若要检测一个人是否感染了艾滋病病毒，你认为可以用PCR扩增血液中的_______。A．白细胞DNAB．病毒蛋白质C．血浆抗体D．病毒核酸