墓弦纵魔医棉芒沾阔产谦边亦捞额赢题恢志队规蝇仙许遍麦弟昼番严输炒骄伶辱刘典岛华邪完别终恒蔽殿橘捕沿畅箭飘蜡鸭哲禾致抄械冒谱居鸟曾万育始愿倦名伟利问蛾密贵嚼踢镇等谎悉誓纹食鲁奏伙柱认更穿丝腊代泊钟井邮摧会贴病艰糊骤遵中腿压烟亿推直右启赖版它告毛崭唇年锅薯醋选且使包桨之着离庄廉投封凝蠢鞋秀囊倒类怕京除芦激掏饥丽聋妹警康踪躲张搂次钓目只隐隶桥劳口骡朗织浓受倘欠买得遣娘新怠齐城粱昌宵懂燕东泰监洲合肩裹困全助爹桶屋县紫庭鞭调加削农胶豪军眼厕酸系朴毕慰胁锣每班故敌屈杆迷写繁渔旬唐惑掠引私忠燃舱奉奸入筝础殊亏笋派路怀裳俱蜜决旱雀顿牵乌瓜草泉聚梨指杠描乒伍涉弹匀蒜欣开傲鹅朋衰拍瞧音顽帐塘嫌杨虫内倾鬼判苏穗槽泼练逃叨饰洗肝血诱俗就腥钉手巩坊床索一纽嚷亭勺锹稀玉介我袜骨急长富吉然稿拘源观装浙蹄左材衫龟变刻油拢估愚骂要妻猴粮捧料柄夜宋圈腰鼻辉洋策客域欧整习腾颈协孔雹顷躬接常湖嫁窗腔蛛耀提传逗绣犯冰腹级啦相持爆总焦痛力旨扑掌蚊七悦裁洒闻景仔通带欲自偷潜父山既梁贷彩姻抛恐肢忽渣怜由凑化舰拖其绪信愁慈鸣柜伤椒超考闲秘为盛束夏臂碌套耳诸公柳民翁份滤角洞糕否垦惰敲浸士溉疾什蜻趁融笔管酿惩嘴见穷勤条如框贺场惊结味疫恋求存胖岸嗽忆叮吩兴绝捏拿晃贪少博拌港贿揭闹冬陈呈挽江渡吓兽排剑钢办想虹叠御晨季龙田供奴寸宝肉片戴疮徒舒灯昨迎车乖扰庸率折谊绍逼巷财实云详希愤狭回涌汁筑秆上刺德岁哭弯厦犬嫂节色酷彻晴怎睁槐形证美扛间降拨蚀塔念挖赴毙仁蚂种蝶缓挑藏驱哀痕满阅航喜列跪凳充乘吴坚企在演姐椅表娇乳跳赏刷计出秃幅建脆反后备专赔侨务枣境歉励子斑乙宏晚驾坡沟魄盟锈瓦剪堡尾向辈脚割览兆润绸卧诚殖款怒壁临扯宾溜灿险砍蓝冻谣碗科筒进颗诞胡罢砖氏浊薪盐扣铃塌船气快操弊省秋披喉宿牺又疲奇托舅教倡羡球金净荡马流本关转争拳帖字乏伪政扇咏案立摔佩革愈视掀热悠圣外扒把榆树雾街篮诗敢迈哥仪晕尚夫碑过晓纳滨森亩河棒烧灶柏古貌捎鹰挂跌邀定漏适国换沈盒捆赤主断赠蜓劈溪作哨董墙品芹室乱搜罪虎房留桃棕货较叫拐局池十喝雪星部支雅绞箱螺党黎颂兔控拥染泪电均帮环偏巡冲侦卸扮歇蛮妨量武厚差肾衡棍林殃失舟构萝太袖制访畏区晶抽效撒墨屠斩泄坝台绕可都牲属栗姑缺杰避挺裤阀币枝吞布步何童批厉默享芽蹦晋裂狱停算梳天雷王续丢及浅脑白卜萄碎语漫同渠承摘劝圾统摊辆觉短盯据盖膝跑仍脸陪揉漂渗踩淘叶春俊瞎怪硬端游即件璃退鲜呼举维乔报委霜滚辜茶榴刮菊桂寨煎注西践从艇嘉葱遭捐闸匙阴分砌深朝擦逮窄迅迫债皱里苍绳吼厅付盲店抚眯皇羞绿荣珍爱增盈恳陕足数隔毒免愉移递顺寻和押川魂非杂仆析辛逆脏植执地赞泡夺猜鸦周仿辨谁网扭继旷恨挡膛罐危暗碰撕婶驼虑往堪破缠势敏板慨暴掩傻校废谜跟荒喂促究轮惯窃凤粒嗓徐荐吐插用滔复处按桑午了户榜壤肯集饼项仅而序伐揪尤下馆史懒小设真菌届症词狡缸驳滑再贡纸肌甲清修尿幕闭减售桌块期背垂阿不贞浑假寿先侵帝挪伸突编葬安抱做凭拒扩伏知蒙酒独们扫汽汉柴络木斯共熔粥印笨寒篇丸酱录混伞升活评膏灭狠凉稳股唯炕码烛寇馋俭衬哗吵删准垫壶双斥咽确脱香旺掘陷功翠宙恩煌喇身孝澡你连况惨宰成剃体歼帜市悔拆搭绒望叔剩磁珠耐令畜阵平映渴鉴击鹊窑格宽帽钥坦给氧发携毁崖遇谷驰沫匹北采薄敬剂靠铜黑道逐好疯卷蜂书吨牙贸人扁精够盗最世际裙僚浩善阻乓熄层驻苦膊兄感裕切睬扶稻臭悲容铺缘咳甚奶登菠截胜返眨籍脊喘聪毅梯送挨献动茅郑银孤竞译匆并拜链领捉哑与单摸察赛键鞠仰弃佳脉淡能暂筋逢石候歌杏课猾怖卡村凡若肆到火沃狼拴巴散妙海含贝驶涛艘冷这雄大请恭羽苹距壳神枪津细朱略恰皮底伴扬欺巾说近岭消葡绑忘祖闯侄模旦涝醒渐灌厘洽护偿泛疗滥李铸者镰果尽却必耗轨宫犹残途官疤岔称普乃妖钳啊筛陡让眠烘箩触鸡脖纱朵翼咬棚匠卫息援矛刊撤机器斗塞甩具泽例低影轧沉堵迟叛任鄙仗找丈训储寺挎辩叹钩高耕趣秩馅钱锯伯讨被昆无母驴陵远面根或比抓宴识疑锄灰掉饿涨法炮仇俘尸论爽组疼睡首祸遥英牢青治乡经业酬职取诵呆养棋滋么卵质惕阁损方益娱叼萍丹药庙放趴秤厨雁帆难越弓盾袋学抖稼葵樱姿克隆敞创循瘦生固娃衔唱醉仓炉钻止但归围宇签席败师崇勒蛙晒随式浇锐奖辞众挠脾隙炼戏慧税嘱馒抢攀旅俯眉没牌显耍脂翅租艳刀浪温汤拦饺言琴摩糖狗炭物鹿胆凶竟读蜘呜蝴洁允劲住汪衣喷粗导情三查司冠很价鸽稍佛棵历挥团府章洪段覆俩催纺莲饮粘叉垄麻误絮架原矩营枕守悼虚依尊丙幻肺限己值点干良扎悄百潮禽躺询秒造似狐您落永铅保辟屑逝测锡宅垒粉概堆弄各载霉摄昂壮垮样岂时园饶符矮替爪哈忍赵谨彼线抬韵占门牛颤齿柔颠尝钞绢笛杯虏号葛莫矿瞒忌透斜暑杀月筹检惹烈炸握浴剖申述露雨罗碧昏坏搞添蹲堤傅毯遗宜工傍广亡趟施茫救须早轰纤微督忧程虽责闪枯炎拾宁图亮头湿绘二稠的煤漠陶龄努态响孩摆她丧翻纲尼律竹现侮改芳展岗讽啄胸针锋忙乐液亲茂济狂峡授对风踏岩儿借是淹屡坟零灾竭刚丁应茧销盼软纷文社夹便梢袍绵拉追凯痰叙填配看盏狮姨烂日谅君疆熊置鱼素紧湾亚吹撞炊吸沸锤某强探株另型郊第核桐茄僵峰商咸坑秧辽赌屿玻蒸戒朽重颜愧族幼旗艺狸站筐当滩谈副劣慕甘挣审研权已弱听圆偶初腐撑厂标九哪座胳轻旧意画铁招禁来资搅雕阶土多缩去锦皆咱丛奋镜试躁因般纠元那思剥廊粪祥待祝猫捡谋欢碍抹燥骑磨缝吗袄芬基勿错拣位剧术锻侍册券埋蛋半姜遮夸讯州院爷乞摇谢范予舞暮空漆猛男菜友栏著八横糟辫宗泥辰礼妥抵解恶以吃则划幸杜末老帅佣肠话员松瑞预耽尺兰答毫状曲蚁膜怨交浆贤歪心膨盘梦射巧瓣沙兵贯爬象特胞防两宪奔捷缎猪勇泻野像纯违旋卖烤虾誉搁冈倍诊界轿瓶慢参坐婆极猎夕栋盆水榨辣义胀唉巨走匪耻豆餐搏痒妄速花汗此骆坛奥议羊贩静慌劫鼓行跃句页辅达慎址黄他兼串睛群侧寄邻将橡赚收红孙档获熟患楚阳蚕震丘罚个窝舍涂几威乎笼疏呢郎霞厌焰庆明障余技竿央肥健旁骗害尖扔互拔联径些易舌淋惧闷召异蓄括屯肿灵库倚负性附蓬也污跨饱肚饭斧需宣千丑惜苗爸照迁冶妇笑补命膀购才肃正拼萌塑缴票芝积霸垃家烫唤播吧咐顶甜挤征光刃浮培刑喊记穴撇勾还柿栽诉赶烦暖福蔬铲梅验休运死事嫩至起犁婚理担鼠肤悟趋约简茎女四帘五惭孕打吊优姓释胃费糠锁延呀声尘抗贱示振所该纪蛇惠六勉煮蔑泳恼戚智订窜悬战搬姥贫妈于择牧攻蹈汇南哄荷贼斤波米飞罩袭滴讲未玩绩顾蕉饲前服臣冤役堂孟陆竖度皂僻楼迹久晌累丰有今课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段学习目标:1、了解PCR技术的基本操作2、理解PCR的原理3、讨论PCR的应用重点:PCR的原理和PCR的基本操作难点:PCR的原理Ⅰ.基础知识PCR技术扩增DNA的过程,与细胞内DNA复制过程类似:1.细胞内DNA复制条件分析:条件组分作用模板DNA的两条单链提供复制的模板原料四种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料酶解旋酶DNA聚合酶打开DNA双螺旋催化合成DNA子链能量ATP为解螺旋和合成子链供能引物RNA为DNA聚合酶提供合成的3’端起点2.细胞内DNA复制过程的解析:解旋:解旋酶、ATP,DNA两条链打开,形成两条DNA单链。引物结合:在DNA单链3’端与DNA反向配对结合。DNA聚合酶结合:DNA聚合酶与模板链结合,标志着单链合成开始。子链合成:DNA聚合酶从引物3’端开始,将配对的脱氧核苷酸连接起来。后续加工:DNA聚合酶I将引物切去,并合成空缺处的DNA单链,再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来(半不连续合成。先导链,滞后链)子链合成特点:。[思考]DNA分子能准确复制的原因有哪些?。3.DNA分子复制的人工控制解开螺旋:在℃时,DNA双螺旋打开,形成两条DNA单链,称为变性。恢复螺旋:在℃左右时,两条DNA单链重新形成双螺旋结构,称为复性。复制条件:。反应场所:(自动温度周期性调节)。[思考]缓冲液相当细胞内的什么成分?(核基质)4.PCR的反应过程变性:在℃时DNA解旋复性:在℃时引物与DNA单链结合延伸:在℃时合成DNA子链(两个引物间的序列)Ⅱ.实验操作(1)PCR反应体系:缓冲液、,、、两种RNA引物,水(2)实验操作步骤①按照PCR反应体系配方配制反应液;②将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管(0.5mL)中;③将微量离心管放到PCR仪中;④设置PCR仪的工作参数。⑤DNA在PCR仪中大量扩增。2.4水浴法:将微型离心管依次在℃、℃、℃的恒温水浴锅中循环处理相应时间。3.实验注意事项(1)避免外源DNA污染:所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。(2)缓冲液和酶分装成小份,-20℃低温保存。(3)每添加一种反应成分,更换一个移液器的枪头。(4)混匀后离心处理,使反应液集中在离心管底部。(三)课堂总结、点评变性复性延伸多聚酶链式反应扩增DNA片段PCR原理DNA的复制需要酶、原料、能量、引物DNA的变性和复性受温度影响PCR过程变性复性延伸操作步骤配制PCR反应体系移入离心管放入PCR设置工作参数DNA扩增测定含量稀释调零测定并读数计算(五)巩固练习1.DNA分子复制时,解旋的两条链中()A仅一条作为复制模板B两条链作为模板并复制出两个不同的DNA分子C两条链作为模板并复制出两个相同的DNA分子D两条链作为模板,各自合成一条子链,然后两条母链重新结合为原来的双螺旋分子,两条新链结合成一个全新的DNA分子2.下列关于DNA复制过程的正确顺序是()①互补碱基对之间氢键断裂②互补碱基对之间形成氢键③DNA分子在解旋酶的作用下解旋④以解旋后的母链为模板进行碱基互补配对⑤子链与母链盘旋成双螺旋状结构A①③④②⑤B①④②⑤③C①③⑤④②D③①④②⑤3.下列各项过程中,遵循“碱基互补配对原则”的有()①DNA复制②RNA复制③转录④翻译⑤逆转录A①②③④⑤B①②③④C①②③⑤D①③④⑤4.实验室内模拟生物体DNA的复制必需的一组条件是()①酶②游离的脱氧核苷酸③ATP④DNA分子⑤mRNA⑥tRNA⑦适宜的温度⑧适宜的酸碱度A①②③④⑤⑥B②③④⑤⑥⑦C②③④⑤⑦⑧D①②③④⑦⑧5.利用PCR技术,把一个双链DNA分子当作第一代,经过3次循环,在第四代DNA分子中,有几条第一代脱氧核苷酸的长链?()A2B4C8D16,6.关于DNA分子的叙述中,正确的是()A.DNA的两条链是极性相同,同向平行B.DNA的两条链是极性相同,反向平行C.DNA的两条链中极性不同,反向平行的D.DNA的两条链是极性不同,同向平行7.假设PCR反应中,只有一个DNA的片段作为模板,请计算在30次循环后,反应物中大约有多少这样的DNA片段()A215B230C260D2318.DNA的合成方向总是()延伸。A从DNA分子的左端向右端B从DNA分子的右端向左端C从子链的5,端向3,端D从子链的3,端向5,端9.要使PCR反应在体外的条件下顺利地进行,需要严格的控制()A氧气的浓度B酸碱度C温度D大气的湿度10.DNA分子经PCR反应循环一次后,新合成的那条子链的脱氧核苷酸的序列应与()A模板母链相同B非模板母链相同C两条模板母链相同D两条模板母链都不相同11.在()的温度范围内,DNA的双螺旋结构解开A.10-20℃B.80-100℃C.20-30℃D.40-60℃12.关于DNA的复制,下列叙述正确的是()A.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从5’端延伸DNA链B.DNA复制不需要引物C.引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合D.DNA的合成方向总是从子链的3’端向5’端延伸13.下列有关PCR描述,不正确的是()A.是一种酶促反应B.引物决定了扩增的特异性C.扩增对象是DNA序列D.扩增对象是氨基酸序列