重组牛胰蛋白酶抑制剂对四氯化碳致大鼠慢性肝损伤的保护作用

书书书重组牛胰蛋白酶抑制剂对四氯化碳致大鼠慢性肝损伤的保护作用杨莉莉１，贺巾超２，董　文３，４，张馨木２，周存志２，任秀宝１，颜炜群２（１．天津医科大学附属肿瘤医院研究所免疫学研究室，天津市肿瘤防治重点实验室，天津　３０００６０；２．吉林大学再生医学科学研究所，吉林长春　１３００２１；３．天津市红桥医院骨科，天津　３００１３０；４．天津市第一中心医院骨科，天津　３００１９２）摘要：目的　观察重组牛胰蛋白酶抑制剂（ｒＢＰＴＩ）对大鼠慢性肝损伤的保护作用。方法　大鼠９８只，随机分成７组，分别为正常对照组、模型组、ｒＢＰＴＩ３个剂量组（２０，４０和８０ＭＵ·ｋｇ－１）、抑肽酶组（８０ＭＵ·ｋｇ－１）和促肝细胞生长素组（１００ｍｇ·ｋｇ－１）。除正常对照组外，其余各组皮下注射四氯化碳制备慢性肝损伤模型。８周后每天ｉｐ给药，给药４周后测定血清谷丙转氨酶（ＧＰＴ）和谷草转氨酶（ＧＯＴ）活性、白蛋白（Ａｌｂ）含量、白蛋白／球蛋白（Ａ／Ｇ）比值、唾液酸（ＳＡ）含量及肝组织羟脯氨酸（Ｈｙｐ）含量，并进行组织病理学检测。结果　与正常对照组比较，模型组大鼠血清ＧＰＴ和ＧＯＴ活性、ＳＡ含量及肝组织Ｈｙｐ含量明显升高，血清Ａｌｂ含量和Ａ／Ｇ比值明显降低。与模型组比较，ｒＢＰＴＩ各剂量组大鼠血清ＧＰＴ和ＧＯＴ活性、ＳＡ含量及肝组织Ｈｙｐ含量降低，血清Ａｌｂ含量和Ａ／Ｇ比值明显增高。肝组织病理观察显示，ｒＢＰＴＩ明显减轻由四氯化碳所致肝细胞脂肪变性及纤维组织增生等病理改变。结论　ｒＢＰＴＩ对四氯化碳诱导的大鼠慢性肝损伤具有保护作用和抗纤维化作用，在所观察的剂量范围内作用效果与抑肽酶相当。关键词：胰蛋白酶抑制剂；抑肽酶；重组蛋白质类；四氯化碳；慢性肝损伤中图分类号：Ｒ９７５，Ｒ９６３文献标识码：Ａ文章编号：１０００３００２（２００８）０３０１９３０６　　　收稿日期：２００７０８２４　接受日期：２００８０３１７　　基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）项目（２００４ＡＡ２０５０２０）　　作者简介：杨莉莉（１９７５－），女，博士，讲师，研究方向为生物制药和肿瘤药物。　　联系作者　Ｅｍａｉｌ：[e-mail]　Ｔｅｌ：[phone]ＤＯＩ：１０．３８６７／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００３００２．２００８．０３．００７抑肽酶（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）是由５８个氨基酸组成的碱性多肽［１］，常从牛肺、胰和腮腺等器官提取，又称牛胰蛋白酶抑制剂（ｂｏｖｉｎｅｐａｎｃｒｅａｔｉｃｔｒｙｐｓｉｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＢＰＴＩ）。抑肽酶是一种广谱的非特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂［２］，长期以来用于急性胰腺炎的治疗［３］，近年来被广泛用于体外循环的心血管手术和多种疾病的治疗［４］。本实验室应用四氯化碳（ｃａｒｂｏｎｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ，ＣＣｌ４）肝损伤模型研究发现抑肽酶对实验性急慢性肝损伤具有保护作用［５－６］，提示抑肽酶在多脏器功能衰竭治疗中具有应用前景。本实验室应用白蛋白信号肽在毕赤酵母真核表达体系成功诱导表达了重组牛胰蛋白酶抑制剂（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＢＰＴＩ，ｒＢＰＴＩ），解决了毕赤酵母无法表达具有正确Ｎ端ｒＢＰＴＩ的难题，并对ｒＢＰＴＩ的理化性质及其对胰蛋白酶活性的抑制作用进行了验证［７－８］。本研究在此基础上，应用大鼠ＣＣｌ４慢性肝损伤模型，以抑肽酶为对照，观察ｒＢＰＴＩ对慢性肝损伤的保护作用，为进一步研究ｒＢＰＴＩ的生物学活性提供实验依据。１　材料与方法１．１　实验动物、试剂和仪器健康Ｗｉｓｔａｒ大鼠，体重１９０～２１０ｇ，雌雄各半，长春高新医学动物研究中心提供，合格证号：医动字第１０５５１１８。ｒＢＰＴＩ由本实验室制备［７－８］；注射用促肝细胞生长素（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｐｒｏｍｏｔｉｎｇｆａｃｔｏｒｓ，ｐＨＧＦ），广东阳江制药有限公司，国药准字Ｈ１０９４０２１，批号０４０４０８３；抑肽酶，深圳丽珠集团丽珠制药厂，国药准字Ｈ４４０２０６４８，批号０５０８１１２；谷丙转氨酶（ｇｌｕｔａｍｉｃｐｙｒｕｖｉｃｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ，ＧＰＴ）、谷草转氨酶（ｇｌｕｔａｍｉｃｏｘａｌａｃｅｔｉｃｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ，ＧＯＴ）活性·３９１·中国药理学与毒理学杂志ＣｈｉｎＪＰｈａｒｍａｃｏｌＴｏｘｉｃｏｌ　　２００８年６月；２００８　　Ｊｕｎ；　２２（３）：１９３－１９８２２（３）：１９３－１９８和白蛋白（ａｌｂｕｍｉｎ，Ａｌｂ）含量测定试剂盒，购自北京化学试剂公司；唾液酸（ｓｉａｌｉｃａｃｉｄ，ＳＡ）和羟脯氨酸（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ，Ｈｙｐ）含量测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。７２２型紫外可见分光光度仪，山东高密彩虹仪器厂；ＴＪ６低温高速离心机，美国Ｂｅｃｋｍａｎ公司；２７００型生化分析仪，湖南长沙医疗器械厂。１．２　动物分组和处理大鼠９８只，按体重随机分成７组：正常对照组，ＣＣｌ４模型组、ｒＢＰＴＩ３个剂量（２０，４０和８０ＭＵ·ｋｇ－１）组、抑肽酶组和ｐＨＧＦ组。除正常对照组外，其他各组大鼠首次按５ｍＬ·ｋｇ－１ｓｃ４０％ＣＣｌ４，以后按２ｍＬ·ｋｇ－１ｓｃ２５％ＣＣｌ４，每周２次，连续１２周，正常对照组用等量花生油代替［９］。实验第８周时，眼眶取血，常规分离血清，测定血清ＧＰＴ活性和Ａｌｂ／球蛋白（ｇｌｏｂｕｌｉｎ，Ｇ）比值（Ａ／Ｇ）。根据ＧＰＴ活性和Ａ／Ｇ比值升高情况进行分层，然后在每层内随机分组。ｒＢＰＴＩ组每天按２０，４０和８０ＭＵ·ｋｇ－１、抑肽酶组和ｐＨＧＦ组每天按８０ＭＵ·ｋｇ－１和１００ｍｇ·ｋｇ－１分别连续ｉｐ给药４周，对照组按５ｍＬ·ｋｇ－１ｉｐ生理盐水。１．３　生物化学指标检测末次给药后２４ｈ，腹主动脉取血，进行ＧＰＴ和ＧＯＴ活性、ＳＡ和Ａｌｂ含量等指标的测定［１０］，取部分肝组织置于冷生理盐水制成１０％肝匀浆液，按试剂盒说明书测定Ｈｙｐ含量［１１］。１．４　组织病理学观察末次给药后２４ｈ，常规方法取肝脏组织固定于１０％甲醛中，石蜡包埋切片，经苏木素伊红（ＨＥ）染色后光学显微镜下观察组织病理改变，并统计各种病理变化的程度。判断肝纤维化的标准：无，无纤维组织；轻，少量纤维组织；中，纤维组织较多，但无假小叶形成；重，可见假小叶形成。判断肝细胞坏死的标准：无，无坏死细胞；轻，坏死细胞≤２５％；中，坏死细胞在２５％～５０％；重，坏死细胞≥５０％。判断脂肪变性的标准：无，无脂肪变性；轻，脂肪变性≤２５％；中，脂肪变性在２５％～５０％；重，脂肪变性≥５０％。判断炎细胞浸润的标准：无，除肝窦内有少量炎细胞外，其他部位无炎细胞；轻，肝窦内散在少量炎细胞，其他部位无炎细胞；中，肝小叶、门灌区炎细胞浸润较多；重，绝大多数肝小叶、门管区炎细胞弥漫浸润。１．５　统计学分析实验数据以珋ｘ±ｓ表示，计量资料采用单因素方差分析和Ｄｕｎｎｅｔｔｔ检验进行比较，计数资料应用ＳＰＳＳ１３统计学软件进行两两比较ＳＮＫ方差分析。２　结果２．１　ｒＢＰＴＩ对大鼠血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性及白蛋白含量和白蛋白／球蛋白比值的影响模型组与正常对照组比较，血清ＧＰＴ及ＧＯＴ活性明显增高，血清Ａｌｂ含量及Ａ／Ｇ比值明显降低。与模型组比较，ｒＢＰＴＩ各剂量组ＧＰＴ活性降低，Ａｌｂ含量及Ａ／Ｇ比值升高，仅ｒＢＰＴＩ大剂量组ＧＯＴ活性降低，该作用与抑肽酶和ｐＨＧＦ作用相近（表１）。Ｔａｂ１．　Ｅｆｆｅｃｔｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｂｏｖｉｎｅｐａｎｃｒｅａｔｉｃｔｒｙｐｓｉｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ｒＢＰＴＩ）ｏｎａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｓｅｒｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｐｙｒｕｖｉｃｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ（ＧＰＴ）ａｎｄｇｌｕｔａｍｉｃｏｘａｌａｃｅｔｉｃｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ（ＧＯＴ），ａｌｂｕｍｉｎ（Ａｌｂ）ｃｏｎｔｅｎｔａｎｄＡｌｂ／ｇｌｏｂｕｌｉｎｒａｔｉｏ（Ａ∶Ｇ）ｉｎｃｈｒｏｎｉｃｌｉｖｅｒｉｎｊｕｒｙｒａｔｓＧｒｏｕｐＧＰＴ／Ｕ·Ｌ－１　ＧＯＴ／Ｕ·Ｌ－１　Ａｌｂ／ｇ·Ｌ－１Ａ∶ＧＮｏｒｍａｌ５２±４９２±１０３１．４±１．７１．０５±０．０９Ｍｏｄｅｌ１７３±１８２２５±３４２４．４±３．００．７３±０．１２ｒＢＰＴＩ２０１５１±２５＃１８８±４９３１．２±１．５＃０．９８±０．０７＃　　　４０１６１±３０＃１８８±４６２９．８±２．３＃０．９３±０．１６＃　　　８０１４７±２５＃１７０±２６＃２９．４±２．３＃０．８９±０．１０＃Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ８０１３４±２４＃１８７±４１＃２９．６±１．４＃０．９９±０．１６＃ｐＨＧＦ１００１５１±２０＃１７４±３１＃３０．６±２．３＃０．９２±０．１５＃Ｔｈｅｃｈｒｏｎｉｃｌｉｖｅｒｉｎｊｕｒｙｒａｔｍｏｄｅｌｗａｓｉｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈｃａｒｂｏｎｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＣｌ４）ｅｘｃｅｐｔｔｈａｔｉｎｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐ．Ａｆｔｅｒ８ｗｅｅｋｓ，ｔｈｅｒａｔｓｗｅｒｅａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ（ｉｐ）ｗｉｔｈｒＢＰＴＩ（２０，４０ｏｒ８０ＭＵ·ｋｇ－１），ａｐｒｏｔｉｎｉｎ（８０ＭＵ·ｋｇ－１）ｏｒｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｐｒｏｍｏｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ（ｐＨＧＦ，１００ｍｇ·ｋｇ－１）ｏｎｃｅｄａｉｌｙｆｏｒ４ｗｅｅｋｓ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｒａｔｓｉｎｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐｓｒｅｃｅｉｖｅｄｎｏｒｍａｌｓａｌｉｎｅ（５ｍＬ·ｋｇ－１）．ＴｈｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｓｅｒｕｍＧＰＴａｎｄＧＯＴ，ＡｌｂｃｏｎｔｅｎｔａｎｄＡ∶Ｇｒａｔｉｏｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ２４ｈａｆｔｅｒｔｈｅｌａｓｔａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．珋ｘ±ｓ，ｎ＝１０．Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１，ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐ；＃Ｐ＜０．０５，ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ．·４９１·ＣｈｉｎＪＰｈａｒｍａｃｏｌＴｏｘｉｃｏｌ　２００８　Ｊｕｎ；２２（３）２．２　ｒＢＰＴＩ对大鼠血清唾液酸及肝组织中羟脯氨酸含量的影响模型组与正常对照组比较，血清ＳＡ和肝组织中Ｈｙｐ含量明显增高。ｒＢＰＴＩ各剂量组与模型组比较血清ＳＡ含量无明显变化，肝脏组织Ｈｙｐ含量明显降低，该作用与抑肽酶和ｐＨＧＦ作用相近（表２）。Ｔａｂ２．　ＥｆｆｅｃｔｏｆｒＢＰＴＩｏｎｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｓｅｒｕｍｓｉａｌｌｉｃａｃｉｄ（ＳＡ）ａｎｄｌｉｖｅｒｔｉｓｓｕｅｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ（Ｈｙｐ）ｉｎｃｈｒｏｎｉｃｌｉｖｅｒｉｎｊｕｒｙｒａｔｓＧｒｏｕｐＳＡ／ｇ·Ｌ－１Ｈｙｐ／μｍｏｌ·ｇ－１ｗｅｔｔｉｓｓｕｅＮｏｒｍａｌ２．９２±０．４５０．４３±０．０４Ｍｏｄｅｌ４．１５±０．０３１．２３±０．２１ｒＢＰＴＩ２０３．８０±０．５９０．８４±０．２９＃　　　４０３．８７±０．５８０．７８±０．１８＃　　　８０３．７６±０．３１０．７８±０．１７＃Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ８０３．１３±０．３２＃０．８１±０．２１＃ｐＨＧＦ１００３．７３±０．６３０．６０±０．１４＃ＳｅｅＴａｂ１ｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ．珋ｘ±ｓ，ｎ＝１０．Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１，ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐ；＃Ｐ＜０．０５ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ．２．３　ｒＢＰＴＩ对大鼠肝组织病理变化的影响对各组肝组织病理变化如肝纤维化、肝细胞坏死、脂肪变性及炎性细胞浸润分别进行统计，结果如表３所示。与模型组比较，ｒＢＰＴＩ（２０和８０ＭＵ·ｋｇ－１）组、抑肽酶组和ｐＨＧＦ组上述各种病理变化均明显改善。图１为各组有代表性的肝脏组织ＨＥ染色结果。正常对照组大鼠肝小叶结构清楚，肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状排列，肝窦结构规整，肝细胞核圆形，胞质红染，为正常肝脏组织结构（图１Ａ）。模型组大鼠肝纤维组织增生明显，将肝小叶分割为大小不等的假小叶，假小叶内中央静脉缺如或偏位，可见肝细胞坏死，肝细胞脂肪变性，胞浆内可见大小不等的圆形空泡，炎性细胞浸