重组蛇毒纤溶酶Fibrolase的复性

第7卷第4期过程工程学报Vol.7No.42007年8月TheChineseJournalofProcessEngineeringAug.2007收稿日期：2006−11−23，修回日期：2007−02−28基金项目：西北农林科技大学农业分子生物学重点实验室基金和郑州大学人才引进基金资助项目作者简介：张守涛(1972−)，男，河南省开封市人，博士研究生，主要从事基因工程药物研究，E-mail:[e-mail]；郭蔼光，通迅联系人，E-mail:[e-mail].重组蛇毒纤溶酶Fibrolase的复性张守涛1,2，史婧1，郭蔼光1(1.西北农林科技大学农业分子生物学陕西省重点实验室，陕西杨凌712100；2.郑州大学生物工程系，河南郑州450001)摘要：将Fibrolase基因克隆入表达载体pET25b(+)，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了高效表达，目的蛋白以包涵体形式存在，占菌体总蛋白的40%左右.比较了直接稀释法、流加稀释法和透析法的复性效率，同时研究了温度、pH值、初始蛋白浓度、复性液中盐酸胍浓度和氧化/还原环境等对复性的影响,得到了较为适宜的复性条件.结果表明，采用流加稀释复性，并在4℃,pH8.5,1.5mol/L盐酸胍,1mmo1/LGSSG,2mmo1/LGSH,初始蛋白浓度10mg/mL及稀释体积为50倍时，复性效率最高.重组Fibrolase蛋白在复性和纯化后的收率可达25%左右.关键词：Fibrolase；大肠杆菌；表达；复性中图分类号：Q819文献标识码：A文章编号：1009−606X(2007)04−0761−061前言Fibrolase是取自美国铜头蝮蛇(Agkistrodoncontortrixcontortrix)的一种锌金属蛋白酶，具有纤活性，无出血活性，它直接作用于血栓，专一裂解纤维蛋白(原)Aα-链的lys413⎯leu414键，是一种比血纤溶酶底物特异性更专一的纤溶酶[1].动物试验结果表明，Fibrolase能产生快速持久的溶栓作用，比纤溶酶原激活剂快6倍，且不引起生理学改变，副反应很少[2]，很有希望成为一种溶栓药物.在以前的研究中，Fibrolase及其突变体Alfimeprase分别在酵母和大肠杆菌中以分泌和可溶的形式进行了表达[3−5]，得到了高活性的重组蛋白，但存在产物不稳定、重复性不好及生产成本高等问题.包涵体是当宿主菌胞质蛋白质高水平表达时，表达的蛋白质不能形成正确的折叠而聚集形成的一种不溶性物质.虽然形成的包涵体需要进行适当的复性使其正确折叠才能获得活性蛋白，但因其具有抗蛋白酶、对宿主毒性小、表达产物稳定及可进行高水平表达等优点，现在很多基因工程药物都采用包涵体复性方法进行生产，如重组人粒细胞集落刺激因子[6]等.为了提高复性率和复性产物活性，防止或降低复性过程中蛋白质聚集体的形成，有效地控制溶液环境由变性条件向复性条件的转化速度，研究人员开发出了多种有效的复性方法，如透析复性法、稀释复性法和超滤复性法.谷振宇等[7−9]采用的脲梯度凝胶过滤复性法、尿素浓度和pH双梯度的离子交换色谱复性法，刘晓阳等[10]采用的基于超滤膜电渗流动的尿素梯度复性法等，都取得了较好的效果.但由于不同蛋白间特性的差异，许多已成功的高效复性方法并不具有很好的普遍性.在针对某一蛋白进行复性时还需在分析该蛋白特性的基础上，通过反复实验和优化来获得最佳复性方法和条件.有关Fibrolase包涵体复性方面的研究尚未见到任何报道.本研究首次报道以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达Fibrolase，并通过对不同复性方法的比较及复性条件的优化，建立了较适宜的重组Fibrolase复性方法，最终获得了高比活的重组蛋白，为以后药理学等方面的研究奠定了基础.2材料大肠杆菌菌株XL1-Blue,BL21(DE3)和表达载休pET25b(+)由本实验室保存，含有Fibrolase基因的克隆载体pGEM-Fibro由本实验室构建[10]，PfuDNA聚合酶、质粒提取和胶回收试剂盒购自天为时代公司，限制性内切酶、T4DNA连接酶为Promega公司产品，肠激酶、凝血酶和纤维蛋白原为Sigma公司产品，引物皆由上海生工生物工程有限公司合成.3方法3.1表达载体的构建以含有Fibrolase基因的克隆载体pGEM-Fibro为模板，用正向引物和反向引物(5′-GAATTCGATATGGAACAGCGTTTCCCGCAGCGT-3′,(5′-CGCGCCTCGAGTTACGGTTTATTTAAAATGCATTG-3′)进行PCR扩增，PCR产物纯化后用NdeI和XhoI酶切，连入表达载体pET25b(+)中，转化大肠杆菌XL1-Blue.阳性克隆经菌落PCR、质粒双酶切鉴定，并762过程工程学报第7卷送上海英骏公司测序.序列正确的表达载体命名为pET-Fibro.3.2Fibrolase表达用构建好的pET-Fibro质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，在含Amp的LB平板上筛选.挑取单菌落，在含50mmol/LAmp的2YT培养基中，37℃下180r/min培养过夜，再以1%的接种量接到同样的培养基中，培养至OD值为0.5∼0.6时加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactoside,IPTG)，使终浓度为1mmol/L,37℃诱导5h.3.3包涵体洗涤和溶解12000r/min离心1min收获菌体，菌体沉淀用1/5体积破菌缓冲液(50mmol/LTris⋅Cl，50mmol/LNaCl,pH7.9)重悬，在冰浴条件下进行超声波破碎，离心并收集沉淀.将沉淀用包涵体洗涤液I(组成见表1)洗涤2次,再用包涵体洗涤液II(组成见表1)洗涤2次，每次10min.4℃下10000r/min离心15min，收集沉淀，最后用pH7.9的50mmol/LTris⋅Cl再洗1次.包涵体用6mol/L盐酸胍(GdmCl)+15mmol/L二硫苏糖醇(Dithiothreitol,DTT)在室温下溶解2h，离心收集上清.表1各种缓冲液组成Table1Buffersinthisstudy3.4包涵体纯化和脱还原剂SephdexG-50柱(Φ2cm×50cm)用缓冲液C平衡后，将浓度约为10∼20mg/mL的1mL变性蛋白液样品在4∼20℃环境中过柱，用缓冲液C洗脱，流速为0.5mL/min，收集目标蛋白.3.5包涵体复性包涵体复性的主要方法有透析复性、稀释复性、超滤复性及近期发展较快的层析复性等.本研究在实验初期曾试图用凝胶过滤层析来复性重组Fibroalse，但在层析过程中沉淀很多，造成层析管路阻塞(结果未报道)，因而放弃此方法.后来在本实验中选用了传统的、在生产中应用较多的透析法和稀释法进行重组Fibrolase的复性，取得了不错的效果.3.5.1透析法复性将蛋白终浓度调整为100µg/mL，装进透析袋，放入20倍体积的缓冲液A+4mol/L盐酸胍中进行透析，6h后将透析液换成缓冲液B+2mol/L盐酸胍，以后每隔6h换液1次，透析缓冲液中的盐酸胍浓度由6→4→2→0mol/L依次降低，最后放到缓冲液B中透析过夜.3.5.2流加稀释复性用恒流泵以20µL/min左右的恒定流速将2mL变性液(含6mol/L盐酸胍,50mmol/LTris)连续流加至100mL复性缓冲液B+1.5mol/L盐酸胍中，缓慢搅拌.流加结束后，在室温下继续缓慢搅拌24h.3.5.3直接稀释复性将一定量的变性溶液(同上)一次性加入到50倍体积的复性缓冲液B+1.5mol/L盐酸胍中，室温下缓慢搅拌复性.3.6复性产物的纯化将复性液上清过用缓冲液D平衡过的HiTrapQSepharoseFF柱，用缓冲液E进行梯度洗脱，并将收集的目的蛋白再过SuperdexG-75柱(Φ10mm×400mm)纯化并脱盐，缓冲液均为D，收集蛋白.取纯化的复性Fibrolase与文献[5]所纯化的Fibrolase各5µg进行活性对比.3.7纤溶活性测定纤溶活性测定采用纤维平板法[11].定量测定根据唐绍庆等[12]的方法改进，室温(25℃)下在10mL离心管中依此加入下列组分(反应总体积为0.5mL)：缓冲液(pH7.5的咪唑缓冲液1份，0.7%CaCl22份，0.85%NaCl4份)0.2mL，终浓度为1U/mL的凝血酶，终浓度为1.25mg/mL的纤维蛋白原(可转化为1.0mg/mL纤维蛋白).混匀后加入50µL复性液，立即振荡数秒，37℃水浴30min，然后冰浴终止反应.12000r/min离心10min，弃上清，用去离子水漂洗3次后，加入3mL0.2mol/LNaOH溶液，沸水浴15min，使纤维蛋白完全溶解，冷却后用分光光度计测定溶液在280nm处的吸光值A280，用以下公式计算总活力，复性效果以总活力表示.纤溶活性=(A280对照−A280样品)×3×1000µg/(0.5mL×30min)=200(A280对照−A280样品)µg/(mL⋅min).BufferCompositionWashingbufferI0.01%TritonX-100,50mmol/LTris⋅Cl,10mmol/LEDTA,pH7.9WashingbufferII2mol/Lurea,50mmol/LTris⋅Cl,10mmol/LEDTA,pH7.9BufferA50mmol/LTris⋅Cl,50mmol/LNaCl,0.5mmol/LZnCl2,pH7.9BufferB50mmol/LTris⋅Cl,50mmol/LNaCl,0.5mmol/LZnCl2,1.0mmol/LGSSG(oxidizedglutathione),2.0mmol/LGSH(reducedglutathione),pH7.9BufferC4mol/LGdmCl,50mmol/LTris⋅Cl,pH6.5BufferD20mmol/LTris·Cl,0.5mmol/LZnCl2,pH7.5BufferE20mmol/LTris·Cl,0.8mol/LNaCl,0.5mmol/LZnCl2,pH7.5第4期张守涛等：重组蛇毒纤溶酶Fibrolase的复性7634结果与讨论4.1Fibrolase表达载体构建和表达构建的表达载体pET-Fibro经PCR和双酶切鉴定，测序结果与预期结果完全相同，且读码框正确.结果表明，Fibrolase以包涵体形式存在，可溶部分未见明显表达带；SDS变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS−PAGE)结果显示，目的蛋白占菌体总蛋白的40%左右(如图1的泳道1).1.Totalcellproteins2.Precipitationofcelllysates3∼5.Washingofinclusionbodies6.Dissolutionofinclusionbodies7.PrecipitationM.Marker图1包涵体洗涤和溶解Fig.1SDSP−AGE(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis)analysisofwashinganddissolutionoffibrolaseinclusionbodies4.2包涵体溶解条件当未加入还原剂时，3种变性剂都不能有效溶解包涵体，而加入还原剂后，溶解效果都很好，其中以6mol/L盐酸胍+15mmol/LDTT溶解效果最好，且不溶物主要为大分子量杂蛋白(图1).这可能是由于Fibrolase含有6个半胱氨酸，在包涵体中形成了许多错误的二硫键，在只有变性剂存在的情况下不能打开二硫键，而加入还原剂DTT后，加入变性剂2h便能溶解绝大部分包涵体.4.3复性条件对复性率的影响4.3.1复性方法对复性效率的影响当Fibrolase蛋白浓度在10mg/mL左右时,直接稀释复性产生了大量的沉淀，上清中蛋白浓度很低，而流加稀释复性和透析复性时复性液只有轻微混浊，上清中蛋白浓度较高.