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重组质粒的转化•外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过各种方法筛选出重组子，并可通过酶切电泳进行重组子的鉴定。感受态•理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。它决定于受体菌的遗传特性，同时与菌龄、外界环境等因素有关。感受态细胞制备方法及原理•目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2法，制备好的感受态细胞可以加入终浓度为15%的无菌甘油，-70℃可保存半年至一年。经过CaCl2处理的细胞细胞膜通透性增加，允许外源DNA分子进入。•该方法简便、快速、稳定•将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，细胞膜通透性发生变化，CaCl2法制备感受态细胞影响因素•细胞的生长状态：对数生长期•试剂质量：分析纯•杂菌和杂DNA污染：所用器皿、试剂均需灭菌•温度：冰上操作转化•是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表型发生相应变化的现象。•在低温下，将携带有外源DNA片段的载体与感受态细胞混合，经过热激或电穿孔技术，使载体分子进入细胞。•进入受体细胞的外源DNA分子通过复制、表达，使受体细胞出现新的遗传性状。将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养，即可筛选出重组子。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。方法及原理•热激法：使用化学试剂（如CaCl）制备的感受态细胞，细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。操作步骤•取100µl感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作)，加入10µl重组质粒DNA(体积不超过10µl)+100µl感受态细胞•将以上样品轻轻摇匀，冰上放置20-30min，于42℃水浴中保温1－2min，然后迅速冰上冷却2min•立即向上述管中分别加入LB液体培养基（不需在冰上操作），摇匀后于37℃振荡培养约45-60min，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物。提高转化效率的方法•感受态质量•质粒DNA的相对分子质量和浓度•防止杂菌和杂DNA污染重组子的筛选•转化后的细胞在筛选培养基中培养，可筛选出转化子蓝白斑筛选•蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。筛选原理•IPTG可以激活lacz'中的β-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。当外源DNA（即目的片段）与含lacz'的载体连接时，会插入进MCS（即靶基因），使α肽链读码框破坏，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。MCS无插入时，互补，蓝菌斑。MCS有插入时，不互补，白菌斑。IPTG诱导的结果：无质粒的受体菌-半乳糖苷酶部分缺失，不能分解Xgal；无抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培养基上培养无菌斑生长质粒转化的受体菌-半乳糖苷酶的缺失被载体产物互补，能分解Xgal。且有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培养基上培养有蓝色菌斑生长带外源DNA插入的质粒转化的受体菌载体产物失活，不能互补-半乳糖苷酶的缺失。不能分解Xgal，但有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培养基上培养有白色菌斑生长抗生素抗性筛选•实验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的。含X-gal的平板培养基中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素，这样，一次筛选可以判断出：未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，长成白色菌落。转基因技术•什么是转基因技术？1983年，世界上第一例转基因植物在美国成功培植，当时就曾有人惊呼：“人类开始有了一双创造新生物的‘上帝之手’。”有人预言，21世纪将是转基因作物的一个转换期，科技含量将有很大的提高。•转基因技术就是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰。人们常说的“遗传工程”、“基因工程”、“遗传转化”均为转基因的同义词。基因工程和选择性繁殖技术有什么不同•转基因技术与选择性繁殖都会改变生物的基因。•转基因技术可以实现基因在不同物种之间的传递和流动。可以实现物种间的基因转移。•转基因技术转移的基因更明确，更有目的性。•选择性繁殖实验过程缓慢。基因工程技术筛选优良品种的周期更短，利用基因工程，可以很容易地进行物种的杂交。23“选择性繁殖”技术24植物转基因方法•直接基因转移方法:基因枪法、PEG介导的原生质体法、花粉管通道法、电激转化法等，其中基因枪转化法是代表。•生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。26花粉管通道花粉管通道法是指在授粉后向子房注射合目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。该方法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。农杆菌介导的植物转基因技术28感染转化选择转基因植株评价与鉴定再生农杆菌介导的植物转基因技术29转基因和克隆技术•克隆是将一个体细胞的DNA移入一个已经被去掉细胞核的卵细胞中，然后刺激这个改造后的卵细胞，使它开始分裂并成为一个胚胎，这个胚胎的基因与体细胞提供者的基因完全一样。•关于转基因，通常因有性生殖造成同种生物个体之间遗传物质的重组.•克隆是对单体的复制。转基因技术可以保持生物基因的多样性，而克隆却没有什么帮助，反而有一定的威胁。30克隆羊“多莉”的产生过程32转基因食品•以转基因生物为原料加工生产的食品。•根据原料来源：动物源、植物源、微生物源•根据功能：增产型、控熟型、高营养型、保健型、新品种型、加工型•最初目标：保护作物•风险评估：环境和人类健康（1）对人类健康的直接影响（毒性）；（2）引起过敏反应的趋势（过敏性）；（3）被认为有营养特性或毒性的特殊成分；（4）插入基因的安全性；（5）与基因改良有关的营养效果；（6）由基因插入产生的任何非预期影响。基因产品的开发现状转基因食品的开发•美国55%的大豆是转基因产品，40%—50%玉米是经过基因工程改变过的。美国超市上有4000多种食品含有转基因成份。•1996年，世界种植转基因农作物的面积为700万公顷。到1999年增加到7500万公顷，美国占了74%，中国只占1%。•2000年美国基因农作物产品的销售额达950亿美元。植物基因工程源源创造新品种，转基因食品的增长是无限的，将不断推进经济增长。36重组子的鉴定及基因表达产物的分析•琼脂糖凝胶电泳检测•聚丙烯酰胺凝胶电泳•SDS-PAGE•核酸分子杂交利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。直接电泳检测法从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。DNA电泳检测法Marker载体重组子根据重组DNA分子大小鉴定重组子原理：有外源DNA片段插入载体后的重组DNA与载体DNA之间的大小差异。基本方法：提取转化子的DNA，经琼脂糖凝胶电泳分离，电泳迁移慢的带是重组DNA的带。此法是对重组子进行分析鉴定的最基本、最简单的方法，只适用于重组子的初步鉴定。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短），从而把不同分子量的肽链分开。电泳buffer电泳buffer点样电泳方向Dalton凝胶中的蛋白质染色：考马斯亮蓝：灵敏度底、只能检出0.3-1μg/带，但可褪色回收。硝酸银：灵敏度高、可检出2-5ng/带。2）转到膜上进行染色。1）直接染色直接染色电泳结果•具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。•杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知核酸序列且已标记的DNA或RNA,称探针。•杂交有固一液相杂交和液相杂交。核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交技术变性复性DNA-DNA杂交双链分子2.1探针（Probe)的概念:一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。此技术由Southern1975年首先设计。被检测对象为DNA。4.1Southern印迹杂交带有DNA片段的凝胶DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳至膜（尼龙膜或硝酸纤维素滤膜）上转膜杂交、显影凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印迹杂交的技术流程白瓷盘玻璃板滤纸凝胶尼龙膜滤纸吸水纸玻璃板重物吸水纸转膜。真空转膜槽滤纸尼龙膜凝胶盖子+-真空转膜