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在人脐静脉血管内皮细胞中的表达1叶顺传，曾秋棠，吴辉文，吕云波华中科技大学同济医学院协和医院心研所，湖北武汉（430022）E-mail：yeshunchuan@gmail.com摘要：目的：构建肿瘤坏死因子受体（TNFR1）绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1/TNFR1，并在人脐静脉血管内皮细胞中表达。方法：分离并培养HUVEC，将已成功构建的融合表达载体pEGFP-N1/TNFR1（另文发表），通过阳离子脂质体Lipofectin介导的方法转染到HUVEC中，RT-PCR检测mRNA的表达，Westernblot检测融合蛋白的瞬时表达，同时在在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察。结果：成功分离人脐静脉血管内皮细胞，重组pEGFP-N1/TNFR1融合表达载体转染HUVEC细胞后，在细胞中检测到TNFR1基因片段，Westernblot可以检测到TNFR1在HUVEC细胞表达，用荧光显微镜观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达。结论：重组pEGFP-N1/TNFR1融合表达载体在HUVEC中获得了表达，融合蛋白具有TNFR1和GFP的双重活性，为进一步研究TNFR转位的调控因素打下基础。关键词：TNFR1；绿色荧光蛋白；人脐静脉血管内皮细胞；克隆近年的研究表明，肿瘤坏死因子（Tumornecrosisfactor，TNF）在心血管疾病，如高血脂、高血压和动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）等的病理生理过程中起着重要的介质作用[1]。研究肿瘤坏死因子受体（TNFreceptor，TNFR）是揭示TNF作用机理的重要途径。在TNF的刺激下，TNFR1可能从反式高尔基体转位到细胞膜，但是，TNFR1细胞内转位通路及调节因子尚不明确[2]。本实验在已构建绿色荧光蛋白融合TNFR1基因的重组载体pEGFP-N1/TNFR1的基础上，拟转染人脐静脉血管内皮细胞（humanumbilicalveinendothelialcells，HUVECs），观察其表达，为进一步研究TNFR1细胞内转位通路及调节因子奠定基础，并为阐明TNF引起的细胞损伤机制提供实验依据。1.材料与方法1.1材料1.1.1主要试剂Trizol试剂、Lipofectin脂质体、OPTI-MEMI无血清培养基购自Invitrogen公司。RT-PCR试剂盒购自大连宝生物。PCR产物纯化试剂盒购自Promega公司。质粒抽提试剂盒、DNAmarker购自北京天根生化。T4DNA连接酶、限制性内切酶KpnI、SacI购自NEB公司。I型胶原酶购自Sigma，内皮细胞培养液(含ECGs、胎牛血清、青/链霉素)购自ScienCellTM研究实验室。国产胎牛血清购自杭州四季青。RPMI1640培养基购自Hyclone公司。vWF因子抗体为武汉博士德公司产品。兔抗人TNFR1多克隆抗体、辣根过氧化物酶（HSP）标记的山羊抗兔IgG购自SantaCruz。ECL检测试剂盒购自Pierce公司。引物的合成和序列测定由上海生工完成。 1本课题得到教育部博士点专项基金资助项目（20040487067）的资助。载体在前期实验已成功构建（另文发表），质粒pEGFP-N1由华中科技大学同济医学院免疫学国家重点实验室惠赠。1.2方法1.2.1HUVECs的分离和培养按Jaffe等[3,4]的方法加以改进｡脐带取自华中科技大学同济医学院协和医院妇产科，健康产妇，剖腹产。在无菌条件下取无扭曲､打折､破损的新生儿脐带，剪去钳痕和凝血块阻塞部分，37PBS℃反复冲洗脐静脉管腔，排空脐静脉，注入37℃预温的0.1%I型胶原酶10ml，37℃孵育10min。收集消化液，加入胎牛血清2ml终止酶反应｡用PBS反复冲洗脐静脉管腔，同消化液一并室温离心，1000r/min离心10min。弃上清，加入内皮细胞培养液（含ECGs，5%FBS，不含抗生素），充分混合制成细胞悬液，转入多聚L赖氨酸铺底的细胞培养瓶，37℃，5%CO2条件下，培养24h，使内皮细胞贴壁｡第二天更换新鲜培养基（含ECGs，5%FBS，100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素），每2~3天更换培养基。用消化液（0.125%胰蛋白酶和0.01%EDTA）消化传代。转基因前予细胞形态学观察及免疫细胞化学染色(ICC)鉴定｡倒置显微镜下见细胞呈多角形排列。用Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学方法进行HUVECs鉴定。1.2.2转染所有的质粒均用Lipofectin转染HUVEC细胞，根据试剂提供商的转染方案进行转染。在脂质体转染前一天，按1×105/ml密度接种HUVEC细胞于6孔培养板，添加无抗生素ECM培养，生长过夜至细胞铺满40-60%。转染前，6µlLipofectin溶于100µl无血清培养基制成A液，室温放置45min。1.0µgDNA溶于100µl无血清培养基制成B液。A液和B液轻轻混匀，室温孵育15min。吸弃培养基，用2ml无血清培养基洗涤细胞一次，弃去培养基。加入0.8ml无血清培养基到A、B混合液，轻轻混匀，然后加到细胞。37℃、5%CO2继续培养6小时。加入2ml含血清培养基，继续培养。所有的转染实验均重复三次以上。48小时后检测转染基因表达。1.2.3转染HUVEC细胞RT-PCR检测TNFR1mRNA的表达转染后48h分别提取细胞总RNA，采用Invitrogen公司的Trizol试剂，按说明书操作方法进行，紫外分光光度计定量后用于反转录。利用Takara公司逆转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA第一链，随后进行PCR扩增。用于检测TNFR1转染入细胞RT-PCR引物如下：上游引物5’-TCCTGGAGCTGTTGGTGGGAATATAC-3’；下游引物5’-TTTTCAGGTGTCGATTTCCCACAAACAAT-3’。PCR扩增条件：945min℃，首次循环9430s℃，60.1℃30s，721min℃，共30个循环，最后7210min℃，45min℃。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析结果。1.2.4Westernblot检测重组融合蛋白的表达质粒转染48h后，提取重组质粒pEGFP-N1/TNFR1组、空载体pEGFP-N1组和空白对照组细胞的总蛋白。培养细胞用冰预冷的PBS洗2次后加入裂解液，冰浴5min，将裂解物12000r/min离心10min后收集上清。Bradford试剂盒确定蛋白浓度。在10%SDS-PAGE上进行分离后，电转移至硝酸纤维素膜上。经5%脱脂奶粉封闭后，与一抗室温孵育1h，再经洗膜，并与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，最后经ECL发光反应，并曝光于X光片上。1.2.5荧光显微镜观察在用重组质粒pEGFP-N1/TNFR1转染HUVEC细胞48h后，采用倒置荧光显微镜观察绿色荧光在细胞中的表达情况。用490nm蓝光激发，确定重组TNFR1/EGFP融合蛋白在细胞中的表达。2.结果2.1人脐静脉内皮细胞的培养与观察在倒置相差显微镜观察可见，生长融合的内皮细胞呈铺路石状镶嵌排列，细胞边界清楚，胞浆丰富，胞核呈圆形或椭圆形，偶见双核，密集处呈铺路石状镶嵌排列，稀疏处为梭形。用Ⅷ因子相关抗原进行细胞免疫化学染色，获取的内皮细胞为棕色，细胞密集区细胞质呈浅棕色，密集区边缘和稀疏区的梭形细胞胞质呈深褐色（图1）。图1人第Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测胞质内见棕黄色阳性颗粒(×300)2.2转染细胞RT-PCR结果质粒转染48h后，在重组质粒pEGFP-N1/TNFR1转染组中扩增出相应大小（721bp）的TNFR1片段，表达量明显高于空载体pEGFP-N1转染，空白对照组则无相应DNA片段（图2）。、2、3为pEGFP-N1/TNFR1组，4为pEGFP-N1组，5为空白对照组2.3转染细胞WesternBlot结果质粒转染48h后，在重组质粒pEGFP-N1/TNFR1转染组中检测出融合蛋白TNFR1-pEGFP，空载体pEGFP-N1转染组、空白对照组则未能检测出相应蛋白（图3）。图3转染细胞WesternBlot结果1为空白对照组，2为pEGFP-N1组，3、4、5为pEGFP-N1/TNFR1组2.4荧光显微镜观察结果采用倒置荧光显微镜观察绿色荧光在HUVECs细胞中的分布,以确定TNFR1/EGFP融合蛋白在细胞中的表达。结果发现在重组质粒pEGFP-N1/TNFR1转染组中,转染后48h,HUVECs细胞中可见弥散有绿色荧光，当表达量高时,在细胞中聚集成团块状、颗粒状（图4）。是一种具有多功能的细胞因子，具有广泛的生物学活性，在炎症反应中起重要作用。研究表明，TNF在抗肿瘤、心血管疾病和自身免疫病等的病理生理过程中起着重要的介质作用[1]。严重的充血性心力衰竭、心肌梗死、心肌炎、扩张性心肌病、心脏移植排斥反应和进行心肺旁路手术患者的血浆TNFα水平显著升高[5]。TNFα在动脉粥样斑块中阳性率高达90%，且与AS的严重程度成正比[6]，在AS的发生、发展中起着重要的作用[7]。心绞痛患者血清TNFα浓度均显著高于正常者(P0.01)[8]。目前认为，血管内皮损伤是AS等血管、血栓性疾病发生的主要原因之一[6]。TNFα的生物学功能是通过细胞表面的相应受体介导来实现的。TNFα受体分两型，即TNFR1和TNFR2，同属于TNF受体超家族。在介导细胞损伤的过程中，TNFα结合并活化肿瘤坏死因子受体TNFR，然后激活下游信号通路，这些通路在内皮细胞等凋亡中起调节作用[9]。TNFR下游信号通路明确，TNFα结合到TNFR受体引起受体三聚体化，从而起始细胞凋亡信号。TNFR1引起的作用非常广泛，它包括杀细胞活性、抗病毒活性、促进成纤维细胞增殖以及细胞程序化死亡、激活NF-κB等多种生物活性物质的信号传递。TNFR2主要传递胸腺细胞和NK等淋巴细胞的增殖信号，通过促进TNFα结合TNFR1而增加TNFR1诱导的作用。但是，目前尚无研究对TNFR1细胞内转位通路及调节因子进行阐述[2]。在未受刺激的细胞，TNFR1主要定位于反式高尔基体，TNFR1是否从高尔基体分泌，分泌颗粒如何转位到细胞膜，以及哪些因子参与调节这一过程目前尚不明确。绿色荧光蛋白(Greenfluorescenceprotein，GFP)是20世纪90年代中期发展起来的一种全新的报告分子。GFP分子质量小，易与其他目的基因形成融合基因，对细胞无毒副反应，而且其化学性质稳定，使用方便，可以在活体细胞中定时观察，所以连接有GFP的载体pEGFP-N1在分子生物学中被广泛应用。血管内皮细胞（vascularendotheliacell，VEC）是TNFα作用的靶细胞之一[10]，它是机体一类重要的细胞群体，在血管通透性屏障、免疫防御及炎症反应中起着极其重要的作用[11]。由于VEC不属于快速自我更新的细胞群体，因此，VEC凋亡后降低了内皮细胞储备[12]，致使血管内皮裂隙增大，通透性增加，引起内皮细胞损伤。由TNFα引起的VEC损伤在很多炎症性疾病的发病中具有重要意义。选用HUVEC作为靶细胞，脐静脉内流淌着含氧量丰富的动脉血，其内皮细胞功能特性接近于动脉内皮细胞，并且直接来自人体，是研究VEC功能紊乱的理想细胞模型。实验选用3～4代HUVEC作为材料，并根据内皮细胞形态及其特异表达Ⅷ因子相关抗原的特点，采用形态学观察和免疫组织化学染色方法