重组酵母菌对牙鲆非特异性免疫能力的影响3

重组酵母菌对牙鲆非特异性免疫能力的影响3王宏田张培军中国科学院海洋研究所实验海洋生物学开放研究实验室青岛提要于年)月间在荣成市寻山养殖场实验了饲喂含有大麻哈鱼生长激素基因的重组酵母对龄牙鲆非特异性免疫能力的影响∀实验分为对照组和个实验组∀对照组的饵料中不含重组酵母菌实验组的饵料中分别含有重组酵母菌1ϕ!1ϕ!1ϕΩ/Ω∀实验表明通过投喂重组酵母菌可以增加牙鲆血清蛋白的含量增强牙鲆血清中溶菌酶及抗蛋白酶物质的活性这种影响与重组酵母菌的含量成正相关∀关键词牙鲆重组酵母菌非特异性免疫学科分类号±越来越多的实验表明通过使用免疫增强剂∏∏可以有效地增强鱼类抵抗外界病原体侵袭的能力同时也可以减轻外界环境胁迫对鱼类的免疫抑制作用∀已有研究表明由酵母菌中提取的葡聚糖在大西洋鲑Σαλµοσαλαρ和虹鳟Σαλµογαιρδνερι中可有效地提高其抗病能力εταλ,εταλ,外源生长激素同样有利于增强鱼类的抗病能力εταλ,≥εταλ,!!∀饲喂含有生长激素的重组酵母菌对于增强鱼类免疫能力的效果是一个值得探讨的问题∀本实验以牙鲆为实验对象考察含有大麻哈鱼生长激素基因的重组酵母菌对其某些非特异性免疫能力的影响∀1材料与方法111重组酵母菌含有大麻哈鱼生长激素基因的重组酵母菌由中国科学院海洋研究所实验海洋生物学开放研究实验室培养∀使用前将重组酵母菌培养液真空干燥于ε低温保存∀112鱼的饲养实验组和对照组的龄牙鲆分别在个培养池中饲喂∀每个培养池的容水量约为饲养实验备用鱼条左右进行通气!流水饲养∀上午!下午投饵各一次∀每一饲养池每天的投饵量约连续投喂∀对照组的饵料不含重组酵母菌实验组!实验组!实验组的饵料中分别含有重组酵母菌1ϕ!1ϕ!1ϕΩ/Ω∀3国家/0课题资助项目号∀王宏田男出生于年月博士∞2∏∏收稿日期收修改稿日期第卷第期年月海洋与湖沼≤∞∞×≥≤∂√113血清的采集与分析从对照组和实验组的备用鱼中分别取条鱼各组鱼的平均体重分别为左右∀断尾取血于ε冰箱中放置使血液凝结分离出血清∀收集上层血清于ε保存待测∀114溶菌酶活力的测定参考有关文献陈昌福等并作适当的修改具体方法如下将溶壁微球菌Μιχροχοχυσλψσοδεικτιουσ,≥产品用1磷酸缓冲液°≥1稀释至波长为时吸光度为1的菌悬液∀将该菌悬液与1血清混合测定反应开始时混合液于的吸光度Α然后将混合液于ε保温冰浴冷却使反应停止于处测其吸光度Α以每血清蛋白每分钟使混合液吸光度降低的数值来表示溶菌酶的活力≈∏#具体计算公式为Ε(ΑΑ)/µµ代表血清蛋白的质量代表反应的时间∀进行吸光度测量时以°≥作空白对照∀115抗蛋白酶物质活力的测定抗蛋白酶活力通过血清中的抗蛋白酶物质抑制胰蛋白酶水解酪蛋白的能力来表示εταλ,∀蛋白酶的活力以一定时间内一定质量的蛋白酶水解酪蛋白的量表示周慧等∀具体操作如下将酪蛋白溶解于11的磷酸缓冲液°≥中制成的蛋白溶液将1酪蛋白溶液与1°≥混合于ε保温加入1胰蛋白酶溶液1于ε保温加热使酶失活然后加入考马斯亮蓝溶液后于测定吸光值∀对照样品中将1的酪蛋白溶液与1的°≥!1胰蛋白酶溶液混合后不经保温直接加热使酶失活然后加入考马斯亮蓝溶液测定吸光度∀记录吸光度的差值∃Α∀测定血清抗蛋白酶的活性时将待测血清用磷酸缓冲液稀释倍然后将1酪蛋白溶液与1稀释后的血清以及1胰蛋白酶溶液混合依上述方法测定吸光度的差值∃Α∀以每血清蛋白每分钟使胰蛋白酶活力降低的数值表示抗蛋白酶物质的活力≈∏#计算公式为Ε(∃Α∃Α)µ,其中µ代表血清蛋白的含量代表反应时间∀进行吸光度测定时用°≥作空白对照∀116血清蛋白含量的测定以牛血清蛋白作标准蛋白用≤亮蓝染色法测定血清蛋白的含量徐宜为∀2结果与讨论从表中可以看出向牙鲆投喂重组酵母菌可以提高牙鲆血清中蛋白质的含量同时可以提高牙鲆血清中溶菌酶和抗蛋白酶物质的活性∀随着饵料中重组酵母菌的含量增高这种影响效果也更加显著π1∀酵母胞壁中提取的葡聚糖作为免疫增强剂在国际上已经实现商品化生产和应用∀在大西洋鲑Σαλµοσαλα!虹鳟Σαλµογαιρδνερι和大菱鲆Σχοπητηαλµυσµαξιµυσ的研究中发现葡聚糖能够增强鱼类体内溶菌酶的活力∞εταλ,×2εταλ,∏εταλ,∀在另外的实验中发现在牙鲆的消化道中可以检测海洋与湖沼卷表1重组酵母菌对牙鲆血清中蛋白质含量!溶菌酶活性!抗蛋白酶物质活性的影响ν××√√∏Παραλιχητηψσολιϖαχευσ(ν)项目对照组实验组实验组实验组血清蛋白含量????溶菌酶活性≈∏#????抗蛋白酶物质的活性≈≅∏#????出纤维素酶和溶菌酶的活性由此看来酵母菌的胞壁可以被牙鲆消化道中的酶所降解∀牙鲆血清中某些激素的含量随着饵料中重组酵母菌含量的增加而逐渐增多的现象王宏田等能够间接证明这一推测∀当酵母菌的胞壁被牙鲆体内的酶降解从而释放出其中的葡聚糖之后葡聚糖作为免疫增强剂使牙鲆血清中蛋白质含量增高同时增强溶菌酶和抗蛋白酶物质的活力∀这可能是重组酵母菌能够增强牙鲆非特异性免疫能力的机制之一∀生长激素对于鱼类非特异性免疫能力的增强作用也为以往的研究所证实∀等和≥等!!等人在对虹鳟的研究中发现外源生长激素能够促进淋巴细胞的有丝分裂增强血清溶血能力等∀≤∏等在金头鲷的单核细胞和淋巴细胞中检测出生长激素的受体生长激素对鱼类免疫能力的影响可能与这类受体的功能相联系这种影响受到神经内分泌系统的调节∏εταλ,∀研究表明投喂重组酵母可以有效地提高牙鲆血清中生长激素的含量王宏田等∀因此重组酵母菌对于牙鲆非特异性免疫能力的增强作用与外源生长激素的作用可能有某些相同的机制∀这可能是重组酵母菌增强牙鲆非特异性免疫能力的另一种机制∀提高鱼体的免疫能力是增强鱼体抵抗病原体侵袭的重要手段∀研究表明与葡聚糖!生长激素相类似其他许多物质也具有提高鱼体免疫能力的功能这类物质通称为免疫增强剂∀免疫增强剂可能通过作用于神经内分泌系统调节鱼类的免疫能力具体的调节途径还需要进一步实验论证∀有关这方面的研究将有助于更深入地了解免疫增强剂的作用原理∀本实验结果表明重组酵母能够提高牙鲆血清中蛋白质的含量增强牙鲆血清中溶菌酶和抗蛋白酶物质的活力∀重组酵母菌对于牙鲆其他免疫能力的影响投喂重组酵母菌是否能够使牙鲆抵抗某些环境病原体的侵染以及最适的投喂时间和投喂剂量等都将是今后需要研究的问题∀参考文献王宏田徐永立张培军等重组酵母菌对牙鲆生长及血清中某些激素含量的影响海洋与湖沼)陈昌福罗宇良蔡冰等饲养水温对草鱼溶菌酶活性的影响中国水产科学)周慧鲁治斌齐杰等蛋白水解酶活力测定新方法生物化学杂志)徐宜为实验免疫学技术北京科学出版社⁄°∏∏∏√√∏∏∏√期王宏田等重组酵母菌对牙鲆非特异性免疫能力的影响ƒ⁄)∏≤≥∏≤∞∏2∏∞∏∞)∏⁄±∏≤ƒ∏∂εταλ,∞2Β2∏∏2∏∏√2∏∏Σχοπητηαλµυσµαξιµυσ.⁄∏)≤∏2≥2√2°°εταλ,∞√2Σπαρυσαυρατα∞)∞∞ƒ√∞≠∏∏√22√ƒ≥∏)∂⁄εταλ,°√∏Ονχορηψνχηυσµψκισσ2∏∏∏)≠≥εταλ,∞2¬∏∏Ονχορηψνχηυσµψκισσƒ≥∏)ƒ≤≤¬⁄εταλ,2∏Σαλµοσαλαρ,¬∏∏∏∏∏∏)∞εταλ,∞2Σαλµοσαλαρ∏Σαχχηαροµψχεσχερεϖισιαεƒ⁄)≥∏√√2∞)≥∏∏Ον2χορηψνχηυσκετα∏√∂∏∏)≥≠εταλ,√∏∏Ον2χορηψνχηυσµψκισσ¬∏ƒ≥∏)≥≠εταλ,∏∏√√∏ςιβριοανγυιλλαρυµ∂∏∏)×⁄≤∂∏∏∞∏¬×∏Ονχορηψνχηυσµψκισσ≥∏°≥≥∏°∏⁄∏∏∏∂ƒ≥°ƒ≥)海洋与湖沼卷ΕΦΦΕΧΤΣΟΦΡΕΧΟΜΒΙΝΑΝΤΨΕΑΣΤΟΝΤΗΕΝΟΝ2ΣΠΕΧΙΦΙΧΙΜΜΥΝΕΑΧΤΙςΙΤΙΕΣΟΦΠΑΡΑΛΙΧΗΤΗΨΣΟΛΙςΑΧΕΥΣ•2°2∏(ΕξπεριµενταλΜαρινεΒιολογψΛαβορατορψ,ΙνστιτυτεοφΟχεανολογψ,ΤηεΧηινεσεΑχαδεµψοφΣχιενχεσ,Θινγδαο,)Αβστραχτ∞¬∏÷∏ƒ∏∏Παραλιχητηψσολιϖαχευσ.∏¬∏∏∏∏1ϕ1ϕϕΩ/Ω¬√×∏∏∏∏∏∏)√√)≈∏#√)≈≅∏#√¬2∏2ΠαραλιχητηψσολιϖαχευσΚεψωορδσΠαραλιχητηψσολιϖαχευσ2∏√Συβϕεχτχλασσιφιχατιοννυµβερ±期王宏田等重组酵母菌对牙鲆非特异性免疫能力的影响