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In-Fusion克隆技术介绍•宝日医生物技术（北京）有限公司•In-Fusion克隆技术介绍24/2/2020•基因克隆背景简介TA克隆限制性酶切克隆平滑末端克隆缺点：连接效率低耗时较长需要特定限制性酶切位点•In-Fusion克隆技术介绍34/2/2020•In-Fusion克隆产品In-Fusion®HDCloningSystem任意载体任意基因片段这是一款让您随心所欲地实现基因定向克隆的产品！•In-Fusion克隆技术介绍44/2/2020•In-Fusion®基因克隆特点•In-Fusion克隆技术介绍54/2/2020•主要内容2In-Fusion®优点及应用实例3In-Fusion®系列产品介绍4常见问答1In-Fusion®克隆技术的原理•In-Fusion克隆技术介绍64/2/2020•2In-Fusion®优点及应用实例3In-Fusion®系列产品介绍4常见问答1In-Fusion®克隆技术的原理主要内容•In-Fusion克隆技术介绍74/2/2020•In-Fusion®基因克隆技术原理示意图In-Fusion专利酶In-Fusion是一种快速、简单、高效的基因克隆技术！50℃，15min单管反应•In-Fusion克隆技术介绍84/2/2020•2In-Fusion®优点及应用实例3In-Fusion®系列产品介绍4常见问答1In-Fusion®克隆技术的原理主要内容•In-Fusion克隆技术介绍94/2/2020•In-Fusion®克隆技术的优点不附加任何多余序列2不受限制性内切酶酶切位点的限制3可同时克隆两个或多个DNA片段41简便、快速、高效的克隆技术•In-Fusion克隆技术介绍104/2/2020•简便、快速、高效的克隆技术•In-Fusion克隆技术介绍114/2/2020•In-FusionHD无论是克隆长基因片段还是克隆多个基因片段都能保持较高的克隆效率。简便、快速、高效的克隆技术•In-Fusion克隆技术介绍124/2/2020•不附加任何多余序列线性化载体任意载体克隆位点目的DNA片段不需要的碱基序列引物设计PCR扩增与载体相同的15个碱基序列In-Fusion连接反应15min不附加任何多余序列的重组载体无缝克隆：不附加任何多余序列ABC•In-Fusion克隆技术介绍134/2/2020•不受限制性内切酶酶切位点的限制In-Fusion克隆不受限制性内切酶酶切位点的限制:•在cDNA序列中插入内含子,荧光蛋白基因•在cDNA序列添加UTRs•转换纯化标签例如Myc转换为His•缺失蛋白表达区域…表达载体选择插入位点PCR扩增纯化目的DNA片段混合引物设计PCR扩增重组载体•In-Fusion克隆技术介绍144/2/2020•可同时克隆两个或多个DNA片段Step2:目的DNA片段扩增Step3:一次In-Fusion连接反应Step1:制备线性化载体片段1片段2片段3线性化载体重组载体•In-Fusion克隆技术介绍154/2/2020•克服传统克隆技术的限制克服其它克隆技术的限制其它克隆技术的限制In-Fusion解决方案•载体的限制•不同克隆试剂盒都需要与之匹配的载体•必须使用提供的载体只要载体末端和插入片段末端具有15个同源碱基，In-Fusion就可以将任意PCR片段插入任意线性化载体中。•必须进行限制性内切酶酶切和连接•需要独一无二、兼容的酶切位点•极少的合适酶切位点In-Fusion不受限制性酶切位点的限制，因此在目的片段及使用的载体中是否存在合适的酶切位点并不妨碍克隆。•亚克隆繁琐•多片段不能同时克隆In-Fusion能够在一次反应中同时克隆多个片段，无需进行亚克隆。•对于大片段克隆效率较低•对于插入片段有限制In-Fusion系统能够高效克隆0.05-15kbDNA片段。•非定向克隆需要筛选目的片段插入方向正确的克隆In-Fusion是基因定向克隆技术，因此无需进行目的基因片段正确插入的克隆的筛选。•会附加多余碱基序列In-Fusion是无缝克隆：不附加任何多余碱基序列。•不适合中型和大规模克隆工程In-Fusion技术已经成功用于多项高通量克隆工程。•In-Fusion克隆技术介绍164/2/2020•In-Fusion®克隆技术的应用应用多片段克隆构建载体模型插入突变位点高通量克隆•In-Fusion克隆技术介绍174/2/2020•应用实例实例：多个DNA片段（1kb,2kb,3kb)同时克隆【方法】使用TaKaRa高品质PCR酶分别扩增1kb、2kb、3kb的目的DNA片段和2.7kb的载体，并将扩增产物混合，使用In-Fusion®HD试剂盒完成克隆。利用高效率的感受态细胞StellarTMCompetentCells（产品编号：636763）转化并进行蓝/白斑筛选。•In-Fusion克隆技术介绍184/2/2020•引物设计及目的基因片段扩增引物的5’末端必须包含与载体末端相同的15个碱基序列引物的3’末端必须包含与目的基因片段相互补的特异碱基序列•In-Fusion克隆技术介绍194/2/2020•载体线性化PCR扩增酶切处理•In-Fusion克隆技术介绍204/2/2020•In-Fusion连接反应In-Fusion专利酶线性化载体目的基因片段反应液直接转化In-Fusion连接反应50℃15min【结果】CloningEnhancer处理，37℃15min，80℃15min•In-Fusion克隆技术介绍214/2/2020•引物设计原则引物的5’末端必须包含与载体末端相同的15个碱基序列引物的3’末端必须包含与目的基因片段相互补的特异碱基序列•In-Fusion克隆技术介绍224/2/2020•引物设计原则•In-Fusion克隆技术介绍234/2/2020•引物设计网络工具在线支持工具•In-Fusion克隆技术介绍244/2/2020•主要内容2In-Fusion®优点及应用实例3In-Fusion®系列产品介绍4常见问答1In-Fusion®克隆技术的原理•In-Fusion克隆技术介绍254/2/2020•产品列表•In-Fusion克隆技术介绍264/2/2020•基础款相关产品5XIn-FusionHDEnzymePremixpUC19ControlVector,linearized(50ng/μl)2kbControlInsert(40ng/μl)In-Fusion®HDCloningKit（639648/49/50)组分•In-Fusion克隆技术介绍274/2/2020•附带CloningEnhancer的相关产品CloningEnhancer的作用：消除PCR反应液中的引物二聚体和dNTP等的影响无需对PCR产物进行胶纯化操作简单In-Fusion®HDCloningKitw/CloningEnhancer(639633/34/35)•In-Fusion克隆技术介绍284/2/2020•Upto5XHigherEfficiency未经处理CloningEnhancer处理CloningEnhancer的实用例•In-Fusion克隆技术介绍294/2/2020•主要内容2In-Fusion®优点及应用实例3In-Fusion®系列产品介绍4常见问答1In-Fusion®克隆技术的原理•In-Fusion克隆技术介绍304/2/2020•In-FusionKit常见问答Q1.如何选择PCR酶？A1.可以使用任何PCR酶。由于科研人员进行克隆表达的实验较多，我们推荐使用高保真的PCR酶。Q2.载体和插入的DNA片段末端结构有限制吗？A2.没有特别的限制。无论是平滑末端、粘性末端或者末端有无A尾均可进行有效的连接反应。Q3.载体和插入的DNA片段的长度有限制吗？A3.没有特别的限制。载体和插入的DNA片段即使超过10kb也可以进行连接反应，只是连接效率会有所降低。插入的DNA片段只要不少于50bp就可进行有效的连接反应。Q4.线性化载体末端是否需要进行去磷酸化处理？A4.线性化载体末端磷酸基团的存在与否不会影响In-Fusion连接效率。因此，不需要对线性化载体进行去磷酸化处理。•In-Fusion克隆技术介绍314/2/2020•技术支持：800-810-6261；010-80720985/86：service@takarabiomed.com.cn：我们将竭诚为您服务！•In-Fusion克隆技术介绍324/2/2020•ThankYou！