实验室基本仪器介绍

实验室基本仪器介绍张鸿2012年7月17日4类常见仪器4类检测仪器4类打断仪器其他仪器自动化移液站AgilentBravoHamiltonBeckman一、离心机离心机类型类型普通离心机高速离心机超高速离心机最大转速(r/min)﹤1000010000～30000﹥30000最大RCF(g)﹤1500015000～70000﹥70000分离形式固液沉淀固液沉淀分离密度梯度区带分离差速沉降分离•一、注意事项：•每次仪器使用都需登记；•严格配平；•离心机运行时不能打开盖子。•二、应用：•DNA、RNA的提取，检测；•酶蛋白的沉淀和回收；•其它生物样品的分离制备离心机转子转子是离心机用于分离样品的核心部件，转子一般可分为以下两大类：固定角转子（Eixed-Angle-Rotor）水平转子（Siwing-Bucket-Rotor）选择合适的离心管和高质量的适配器，防止离心过程中离心管破裂平衡离心管，对称摆放离心管固定角转：分散摆放水平转子：重量相同的吊篮对称摆放在转子轴上安装转子检查转子和舱体是否干燥选择合适的转子务必事先阅读操作手册注意：离心机都是不同的！离心机的正确使用按开始键，等到速度到达设置速度，如有不正常噪音或抖动，务必马上停止运转设置离心时间和转速，不要超过转子所允许的最高转速确保离心机盖被盖好确保水平转子的吊篮正确安装，并运动自由旋紧转子盖，没有旋紧的转子盖可能会损伤转子或离心机盖和舱体离心机的正确使用离心机的操作注意事项•离心机使用时要放置在平稳、坚固的台面上。•离心机只能用于特定的实验，严禁离心爆炸性或有剧烈化学反应的物质，运行时严禁敲打和移动•负载必须平衡，相对的离心管类型要一致，注意转子上关于最大负载的信息•若马达上有腐蚀或机械损坏的痕迹，严禁使用•最大转速时离心物质的密度不可超过1.2g/ml。•离心有机溶剂（如苯酚、氯仿）时，塑料管会老化•离心前封紧离心管盖，否则离心时管盖弹开会损坏离心机•离心机用完后关上电源，保持盖子打开，不要扣紧•双手同时用力关闭离心机盖，当心夹伤手指•在离心过程中如发现异常现象，如不正常噪音及振动，应立即停机检查•严禁擅自安装和修理离心机，相关工作必须由专业工程师完成离心机操作注意事项•转子和转子盖必须旋紧，否则严禁离心，必须悬挂同样的吊篮•转子工作在高压和很大扭力的环境下，依靠着电镀层来保护铝制转子免受大部分化学试剂的腐蚀。因此微小的划痕也会造成内部物质的严重伤害。当心腐蚀性的化学品，如强碱和中性碱、强酸、汞离子溶液、铜和其它重金属离子、氯化合物、浓盐和苯酚。如果转子被污染，立刻用中性洗液清洗，尤其对于固定角转和吊篮的钻孔非常重要。•不要使用有明显腐蚀或机械损伤痕迹的转子和吊篮，请定期检查配件•严禁使用损坏的转子二、真空离心浓缩仪eppendorfConcentratorplusThermoRC1010浓缩仪的注意事项与应用•二、应用：•1.再浓缩样品；•2.去除样品中的醇残留；•3.干燥功能；•4.冻干样品；•一：注意事项1.浓缩前注意配平；2.注意密封；电泳类型特点主要应用琼脂糖凝胶电泳凝胶孔径较大1.分离大分子核酸，分子量在100bp以上；2.华大实验平台主要用于分离DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶孔径较小1.分离小分子核酸，分子量在100bp以下；2.华大实验平台主要用于分离SmallRNA毛细管电泳分辨率高1.测序（3730）；2.样品或文库的质控（2100）脉冲场电泳系统分辨率高1.分离大分子核酸，分子量在10k以上2.华大实验平台主要用于R&D大片段组常见的电泳类型三、电泳仪器设备琼脂糖电泳使用方法及注意事项血的教训：世界可以改变，但电极方向万万不能变琼脂糖水平电泳槽使用注意事项一.用途：EB胶电泳，用于样品检测二.注意事项：1.EB（溴化乙啶）为强致癌物，使用时需特别小心；2.红色区域为EB污染区，必须严格控制污染区的范围，防止污染区扩散电泳结果凝胶成像系统用途：图像的拍摄和分析，包括：•DNA/RNA，蛋白质电泳图像（主要）•荧光及发光成像；•杂交膜图像；•培养皿菌落图像；2.打开反射白灯灯开关。3.关闭反射灯开关，打开透射灯开关4.调节焦距，使图像清晰5.拍摄并保存，完毕请立即关闭灯源电源6.工作完毕，关闭软件窗口1.双击桌面上的图标，进入软件：使用方法凝胶成像系统的注意事项•严格区分污染区与非污染区，注意防止污染区向非污染区扩散•仪器配套的电脑专机专用，不要随意上网，实验资料定期备份，以保证实验资料的安全；•使用紫外灯源，拍摄完毕请立即关闭灯源电源，以延长紫外灯管及紫外滤光片的使用寿命，同时降低DNA链被破坏的风险；•紫外投射光源在拍完胶后，请用软纸及无水乙醇擦净玻璃表面，以防含盐量高的电泳缓冲液干结于紫外玻璃表面影响以后的图像质量和紫外线的透过强度；•工作完毕后请关闭主机及摄像头的电源辐射低安全性高使用范围广DarkReaderTransilluminators（蓝光切胶仪）DarkReader注意事项1.DarkReader存放在暗房中，暗房为EB污染区，需注意EB污染注意事项2.使用DarkReader时,需佩戴防护眼镜、口罩和手套3.严格要求：废刀片需放到专用回收盒1.PCR仪工作原理•变性：双链DNA在90～95℃变性，形成单链•退火：迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上•延伸：快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸四、PCR仪PCR仪使用注意事项•通风：仪器需放置在通风良好的实验台上，左右两侧至少须保证30cm的通风空间•反应管的布置：实验所需PCR管及样品较少时，一般将试管放置在样品槽中间位置以避免样品挥发及实验结果误差•热盖：盖压紧热盖时,当旋动手轮听到“咔咔”声后即可，这样可保证热盖压紧又不会因压力过大导致样品管变形•预约使用后请按时使用，超出时间半小时则视为自动放弃使用。•使用程序前请先浏览程序，不要随意更改程序。•PCR使用前应注意检查程序设置是否正确，确认运行正常，第1个cycle开始后再离开PCR仪五、Thermomixercomfort1.5ml离心管专用Thermomixer使用方法•特性：舒适型恒温混匀仪同时提供孵育和混匀两个功能，温度控制范围从室温以下13℃至99℃•用途：酶切反应（例如DNA限制性酶消化)、cDNA的逆转录合成、蛋白酶K的消化、免疫沉淀、转化、DNA、RNA和蛋白质的变性、从琼脂糖凝胶中回收等Thermomixer控制面板Thermomixer显示屏Thermomixer使用注意事项•不要在仪器上使用具有腐蚀性的化学试剂，例如强碱弱碱、强酸、丙酮、甲醛、卤化烃或者酚•如果仪器被腐蚀性化学试剂污染应立即用中性清洁剂处理六、荧光定量PCR仪1.实时荧光定量PCR相关概念•实时荧光定量PCR(RealtimeQuantitativePCR)：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法荧光定量PCR扩增曲线示意图•基线(Baseline)：扩增曲线中的水平部分•阈值(Threshold):高于基线但处于扩增曲线的指数增长区范围之内的荧光水平（荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍）•Ct值：扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数基线阈值Ct值Xo2.实时荧光定量PCR数学原理理想的PCR以2n次方，即：X=X0×2nPCR扩增的真正情况：X=X0(1+e)n荧光定量PCR标准曲线示意图Ct值与起始DNA浓度的对数成线性关系SYBRGreen染料法SYBRGreenI作用机理TaqMan探针法TaqMan探针TaqMan探针定量原理实验流程•稀释标准曲线•稀释样品•配置反应预混液•上样•设置反应程序•运行实验•分析实验结果七、Agilent2100Bioanalyzer（安捷伦2100生物分析仪）注意事项•实验前需取出试剂盒室温平衡半小时•测量DNA或者RNA时需注意压胶器顶部元件的位置•加样时，枪头应伸至芯片底部，避免气泡的产生Agilent2100和LCGX检测原理（一）检测原理：通过微流体技术对样品进行分离。当加入电压时，与荧光染料结合的样品便在芯片上的显微蚀刻管道进行分离。样品流动过程中不同DNA片段根据其大小被分离，并通过激光激发荧光，使其被仪器检测到。Agilent2100芯片（内部构造）CaliperDNA（内部构造）Agilent2100和LCGX检测原理（二）定量：1.定大小：ladder会根据自身的各个条带（已知size）及其相对应的迁移时间，形成一个迁移时间和size的函数关系，样品孔中的特定的DNA片段就能根据迁移时间算出size。Agilent2100和LCGX检测原理（三）2.定浓度：使用marker对DNA定量是一个多步骤的过程。第一步，将特定DNA片断的面积与各个样品中存在的marker的面积进行比较。第二步，使用经验校正因子来校正已知谱带的面积。第三步，由校正面积计算得出未知谱带的浓度。Agilent2100和LCGX检测原理（四）3.Agilent2100HighSensitivityDNAassay：可对于pg级样品的精确定量，可检测的样品片段大小范围为50-7000bp,浓度范围为5-500pg/ul。4.CaliperHTDNA1K（目前QC实验室使用只有用一种HTDNAIK)：检测样品片段大小范围为25-1000bp，浓度范围为0.1-50ng/ul2100与LCGX的比较Agilent2100CaliperLabchip检测原理捕获镶嵌有荧光染料的DNA样品信息，并转换计算出片段大小和浓度。与Aglinet2100一致功能适用于DNA、RNA、蛋白质及细胞荧光参数的流式定性及定量分析适用于DNA、RNA及蛋白质定性及定量分析检测范围种检测范围：DNA1000kitDNA12000kit，HSDkit；可以精确到pg。目前只使用一种HTDNAIK通量通量低，12个/芯片；1个/3.3min96和384/芯片；速度快，可达68s/样品（DNA），包括进样、分离、检测、分析及管路系统清洗全过程；自动化升级，可自动加样成本成本较高，一张芯片可以回收使用一次（24个）低消耗，低成本，一张芯片可检测2000多个样品样品消耗1ul1.2-1.5ul（要进行稀释）10-15ul体系八、NanoDropND-1000•分光光度计：可检测核酸、蛋白、细胞等核酸浓度检测范围2ng/μL-3700ng/μL•使用简单、迅速、节省样品；光径1mm上样只需1-2μL•每次使用前必须以纯水校准检测前必须做空白对照•打开上电极片时不可拔线整机的校准为6个月一次NanoDropND-8000特点：可同时检测8个样品NanoDropND-8000•注意事项：•1、使用前后必须用纯水清洗干净；•2、上样前应把样品混匀，保持样品的均一性•3、样品中不能有气泡存在•4、推荐使用八道排枪上样，避免上样过程中液体蒸发而带来的误差影响•5、枪头应避免接触到检测台九、Qubit•荧光计：可检测核酸、蛋白•使用方便、节省样品、精确度高根据样品和检测要求的不同，选用不同的检测试剂盒•不同的试剂盒使用方法不同，我们常用的是Quant-iT™dsDNABRAssayKit检测前要先进行标准曲线校准•必须使用薄壁、透明的0.5mLPCR管定量方法作用原理优点/缺点功能具体使用例子电泳分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系低成本；样品消耗大，操作繁琐，污染环境，受人为影响。定量/片段大小分析样品检测，PCR产物检测NanaDrop分光光度计，利用吸光度定量操作简便，几乎没有成本；受样品纯度影响较大，定量不准。定量样品检测Qubit荧光计，通过添加染料定量准确度较高定量样品检测Agilent2100微流体技术对样品进行分离准确度高，人为影响较小；成本高通量小。定量/片段大小分析文库检测QPCRSYBRGreen染料法和TaqMan探针法准确度最高，特异性好；成本高，人为影