非那西丁体外温孵实验

成员：实验目的1.肝微粒体温孵液中对乙酰氨基酚浓度测定方法的建立。2.熟练操作HPLC。3.了解肝微粒体。实验内容1.建立非那西丁体外温孵实验测定其代谢速率的实验方案。2.开发大鼠肝微粒体温孵液中对乙酰氨基酚测定的方法，制备对乙酰氨基酚的标准曲线，并采用HPLC法建立标准曲线用于肝微粒体温孵液中对乙酰氨基酚浓度测定。肝微粒体简介肝细胞内还含有肝微粒体，是药物代谢及生物转化的重要场所。肝微粒体实质上由内质网碎片和核糖核酸颗粒组成。内含多种与过氧化氢有关的酶系，又称过氧小体，内含胆固醇合成酶系，类固醇，胆红素和药物结合酶系，以及与药物代谢有关的酶系，可使脂溶性药物代谢成水溶性药物，经肾脏排泄。肝微粒体受到损害时，药物代谢发生障碍，药物作用时间延长。制备肝微粒体的方法有超速离心法、钙沉淀法、聚乙二醇法等。实验过程一、肝微粒体温孵液的制备。肝微粒体的制备方法:1.取大鼠禁食24h,断头处死放尽血液，迅速剖开腹腔取出肝脏，剪碎肝组织，用预冷的Tris缓冲液洗净血污，再用滤纸吸干表面水分后称重，按1:3加入PBS后，加水至1000ml，冰浴，用玻璃匀浆器制成肝匀浆，于4°C，12500r离心20min，取上清液，与88mmol/LCaCl2混匀，4°C27000离心20min，取沉淀，再用0.1mmol/LTris缓冲液冲洗，4°C27000离心缓冲20min，取沉淀。实验过程2.重悬沉淀将沉淀物悬浮于含20%甘油的磷酸钾缓冲液中（1g组织加入1ml含20%甘油的磷酸钾缓冲液），反复在冰水浴中吹打均匀，冻存管分装后置-80℃冰箱内保存待用。3.蛋白定量采用BCA法测定肝微粒体蛋白浓度。二、温孵实验。肝微粒体（0.2mg/mL,80μL），非那西丁溶液（5，7.5，10，15，20，25，30，40，60，80，100μmol/L）,100mmol/L磷酸钾缓冲（pH7.4）37℃水浴预温孵5min。加入NADPH体系溶液（10mmol/L葡糖－6－磷酸、1U·m/L葡糖－6－磷酸脱氢酶，4mmol/L氯化镁，启动剂，40μL），在37℃水浴温孵30min后，加入冰甲醇（终止试剂，100μL），终止温孵。实验过程实验过程（为了考察大鼠微粒体反应中合适的终止试剂，对冰甲醇和冰乙腈的终止效果进行比较分析。发现选用冰乙腈作为终止试剂时，对乙酰氨基酚出峰位置存在干扰，而选用冰甲醇时，无内源性干扰，因此选用冰甲醇作为终止试剂。）4℃下12000r/min离心15min，取上清液40μL进行HPLC分析。实验过程三、HPLC测定肝微粒体温孵液中对乙酰氨基酚浓度。色谱条件：ShimadzuShim－PackVP－ODS柱(150mm×4.6mm，5μm)流速：1.0mL/min柱温：室温检测波长：245nm采用梯度洗脱：流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠缓冲液（pH4.3），B为乙腈。0～12min，A—B(90∶10)，12～17min，A—B(75∶25)，17～29min，A－B(75∶25)，29～35min，A－B(90∶10)，35～40min，A－B(90∶10)HPLC四、建立标准曲线与测定非那西丁体外温孵液代谢速率。建立对乙酰氨基酚标准曲线取对乙酰氨基酚储备液，已含有失活微粒体的甲醇水溶液(1∶1)稀释成0.2，1，2，5，10，20μmol/L的系列标准微粒体样品，分别加入等体积的内标(10μmol/L间乙酰氨基酚)，取20μL按照色谱条件进行HPLC分析，测定对乙酰氨基酚含量。以对乙酰氨基酚与内标峰面积比值(Y)为纵坐标，对乙酰氨基酚浓度(X，μmol/L)为横坐标，绘制标准曲线。数据处理记录HPLC中对乙酰氨基酚和间乙酰氨基酚的峰面积，通过标准曲线计算出产物中对乙酰氨基酚浓度，以非那西丁浓度与对乙酰氨基酚的生成速率绘制曲线。通过米氏方程V=Vmax·[S]/(Km+[S])，采用双倒数作图法，计算大鼠肝微粒体中非那西丁脱乙基化反应的Vmax和Km。再见不用谢