微生物标本采集及处理

微生物标本采集及处理临床微生物学在近20年取得了全面进步，向着自动化、基因组学、蛋白质组学技术快速发展并在临床诊治中发挥着重要作用。临床实践中标本采集质量在微生物学检测中的意义越来越重要，合格的标本是获得准确检验结果的先决条件，检测前标本的留取和运输环节的质量控制是实验室和临床之间良好的沟通和衔接的关键。微生物结果的影响因素针对性的检验申请病人准备标本的采取标本的运输标本检验危急值报告标本的保存和处理结果审核和批准分析前分析中分析后研究显示，影响检验结果准确性的因素中检验前标本质量好坏约占70%。临床微生物学检测结果须要综合分析和解读，为临床提供指导，包括检测前标本质量、微生物代谢、生长和死亡、宿主的反应及抗生素的影响等。检测前标本质量包括标本的采集、运输、储存和处理，其直接影响实验室检测结果的准确性，也关系到患者的诊断、治疗、预后乃至医院感染控制，可导致患者住院时间延长、费用增加及实验室诊断错误。临床微生物实验室要获得准确的结果，须要临床科室进行合理的标本选择和正确的标本采集及运输；检验科应用适宜的检测方法，并进行恰当的结果解释，为临床医生提供感染原因、微生物病原种类和药物敏感性（药敏）结果；同时须临床医生、护士和微生物实验室实验员之间的密切配合。标本处理10原则拒收不符合实验要求的标本，微生物学工作者应准确、负责地向临床科室阐明和解释标本拒收条款和正确采集方法。临床医师不应要求微生物报告包罗万象，因为提供不相干的信息可能导致不准确或不恰当的治疗。标本信息应准确、完整，以便于准确地进行临床解释，包括详尽的采集部位和临床信息----《感染性疾病微生物学实验室诊断应用指南（2013年）》实验室必须严格依照既定的标准操作手册并接受法律监督。实验室应建立技术规范，这种规范并不是狭义地单纯为实验人员设立权限，而是建立更好的相互交流与尊重，以及良好的协作关系。实验室需要的标本多样，体液、组织及提取物是外伤等微生物学常需采集的标本；而拭子一般用于鼻、咽部和病毒性呼吸道感染标本的采集。标本应在抗生素使用前采集，以避免因抗生素使用造成的假阴性结果。药敏试验应针对临床典型分离株，不必对所有培养获得的微生物进行药敏试验。应避免“背景干扰”，躯体很多部位的正常寄生菌群很容易污染标本，下呼吸道标本（痰）、副鼻窦、暴露伤口等标本的采集应特别小心。微生物实验室报告结果应准确并与临床密切相关，具有临床价值。血培养BloodCulture微生物实验室的一项重要功能是诊断血液系统感染（bloodstreaminfections,BSIs）。大多数引起BSIs的病原菌应常规血培养48h检出，少数病原菌培养时间超过5d，这些病原菌培养常需要复杂的营养环境，如嗜血菌属、心杆菌属、艾肯菌属、金氏杆菌属和布鲁杆菌等。常规培养可检测多数引起心内膜炎感染的病菌，但巴尔通体属和考克斯体属常规培养多为阴性，需要血清学或分子生物学辅助诊断。在少数培养为阴性的感染者中，对有价值的标本进行分子生物学检测（包括16S-RNA和DNA测序）有助于诊断。采集时间根据研究表明细菌通常在寒战和发烧前1小时入血考虑到可操作性，血培养标本应同时采集或在尽量短的间隔期内采集。间隔式采血法仅适用于确诊持续性菌血症如：细菌性心内膜炎或其他脉管内感染虽然血培养阳性率与体温变化看上去相关性不大，但临床仍应遵从“（下一次）用药前”或“停药24小时后”采血！血培养次数怀疑菌血症的成人患者：采集2-3套血培养标本（不同部位）。婴幼儿患者：采集2次血培养标本（不同部位）除特殊情况外，在采取血培养后的2-5天内，无需重复采取血培养。可疑为持续性菌血症：如心内膜炎、导管相关血流感染，间隔(1--24h)几次取血监测、捕捉、指导治疗。采血量成年患者：推荐的采血量为每套不少于10ml，每瓶不少于5ml；婴幼儿患者：推荐的采血量，每瓶不少于2ml。备注：如果实验室收到采血量不足的标本仍需进行培养，则需在报告单上注明：“送检血液标本量未达到要求，会影响结果的灵敏度”。血培养的采集从静脉取血；不宜从静脉导管或静脉留置口取血；如必须从留置导管内采血，应同时从外周静脉采集另外一个血培养标本，以帮助阳性结果判读。不主张换针头入瓶有血的培养瓶不可放入冰箱保存。血培养的运送采集后血培养瓶应立即送往实验室（2小时内）接种前后的血培养瓶不得冷藏或冷冻。任何延误送入自动连续监测血培养仪的行为将会延误或阻止细菌生长的检测；血培养瓶保留在室温不得超过数小时；血培养污染污染导致的血培养假阳性是一个较为普遍的问题，即使采用最好的血培养标本采集方法也很难将污染率降至2%以下。血培养假阳性结果将导致不必要的抗生素治疗，延长住院时间，增加患者负担和细菌耐药性的选择性压力。准确辨别污染能极大减少相应的花费，并有利于降低以后的污染率。但就目前来说，判断血培养污染的金标准并不存在，比如凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）既是最常见的污染菌，也是现在常见的菌血症病原菌之一，其临床意义的判定仍是一个世界性难题，需要临床医生和实验室人员相互沟通，综合分析。血培养污染的鉴别主要依靠以下几个方面：微生物鉴定、阳性检出时间、重复培养结果以及临床特征等。微生物菌种鉴定对判断血培养污染的价值：当分离出的微生物为金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌以及其他肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌、白色假丝酵母菌时，90%以上是血流感染病原菌。分离出化脓性链球菌、无乳链球菌、产单核李斯特菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌、脆弱拟杆菌、其它假丝酵母菌和新型隐球菌时污染的可能性更低。相反，棒状杆菌、微球菌、气球菌、芽胞杆菌、丙酸杆菌、草绿色链球菌和凝固酶阴性葡萄球菌等很少是菌血症的病原菌。血培养阳性瓶数量对判断血培养污染的价值：心内膜炎或血流感染患者所有或大部分血培养瓶为阳性，相反，血培养污染经常只有一瓶为阳性，这是血培养操作指南中推荐血培养应两套四瓶（双瓶双侧）的一个重要原因。可以用以下公式解释两份以上血培养的临床价值：如果一所医院血培养的污染率为3%，则某患者两个血培养（不同部位采血）均为阳性且污染同一种细菌的可能性为0.09%（3%X3%）。呼吸道标本RespiratoryCultures咽拭子运送培养基可以运送需氧、厌氧、苛养菌4℃或RT24或48小时鼻拭子深部鼻拭子一般与咽拭子的信息等值。相对于诊断深部感染，鼻拭子更适用于侦测健康携带者。深部鼻拭子可用于诊断化脓链球菌和白喉棒状杆菌感染，或金黄色葡萄球菌与化脓性链球菌暴发感染时调查用。拭子标本采集后应立即送检，室温运送时间小于2小时，如果不能立即接种，必须装在无菌运送培养基中，避免由于干燥而使某些细菌死亡。检测淋病奈瑟菌或脑膜炎奈瑟菌的拭子应放人含碳的转运培养基，采集后2小时内接种平板，以防细菌死亡。下呼吸道标本LowerRespiratoryTractSpecimen自然咳痰诱导痰气管内吸取物支气管肺泡灌洗液支气管灌洗液肺部组织下呼吸道标本收集所有病人的下呼吸道标本应在采集后立即送至微生物室，并于1小时内接种室温下放置1h会降低肺炎链球菌、流感嗜血杆菌的分离率而定植于上呼吸道的非致病菌则会过度生长。下呼吸道标本勿放冰箱或运输时勿置于冰块中痰液标本采集时间：用抗生素前，采集标本以清晨为佳，采集前应先用冷开水充分漱口，以免口腔正常菌群污染标本。采集方法：自然咳痰：必须用清水漱口3次，应包括咽喉部，立即用力咳出痰，于灭菌容器或输送培养基中。支气管镜或支气管毛刷:由医生采集，建议直接种入输送培养基。对于痰量少或无痰的患者可进行诱导咳痰，及采用雾化吸入加温至45°C的100g/LNaCl溶液，使痰液易于排出。运送要求标本采集后尽快（小于2小时）送至实验室，不及时运送可导致肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等苛养菌由于不适应外界环境和自溶现象而死亡。延迟送检或待处理标本应置于4°C冰箱保存（疑肺炎链球菌感染、流感嗜血杆菌等苛养菌感染标本不能冷藏），以免杂菌生长，但保存标本应在24小时内处理。对可疑烈性呼吸道传染病（如SARS、肺炭疽、肺鼠疫等）的患者检验标本，在采集、运输或保存过程中必须注意生物安全防护！标本质量带血痰唾液or诱导痰脓痰粘液样痰用革兰氏染色来评估呼吸道标本是否合格痰标本10鳞状上皮细胞/每低倍视野=拒收肺炎-可接受的不合格标本评述很少的鳞状上皮细胞10个每低倍视野许多鳞状上皮10个/低倍视野可以在玻片上看到许多鳞状上皮细胞，说明在采集时受到了上呼吸道分泌物的污染或口水的污染。很多的中性粒细胞很少有或没有中性粒细胞免疫抑制的病人也会出现中性粒细胞减少中性粒细胞和上皮细胞都很少的标本需要培养很多中性粒细胞混合有形态多样的细菌（革兰氏阴性杆菌，纺锤形，革兰氏阳性球菌）吸入性肺炎标本革兰氏染色的典型形式，培养只会培养出正常菌群，所以革兰氏染色是用于诊断的方法。许多或中等量的中性粒细胞，以一种形态的细菌为主酵母菌样，酵母菌是一种很少引起肺炎的细菌，常由口腔污染成双革兰氏阳性球菌，短链=肺炎链球菌革兰氏阳性菌成群排列=金黄色葡萄球菌革兰氏阴性球杆菌（小）=流感嗜血杆菌革兰氏阴性杆菌大且肥厚=肺炎克雷伯菌或其他肠道菌革兰氏阴性双球菌=卡他莫拉菌许多不着色的有折射的杆状细菌可能是肺结核，抗酸杆菌不能被革兰氏染色所染色。呼吸道标本的涂片评估模式尿培养标本UrineCulture用于尿液培养的标本肾活检或肾抽吸物（外科）耻骨上膀胱抽吸物（孕妇，婴儿，全膀胱）微导管尿（内部导管和外部导管）-老年人中段尿，清洁留取——急诊成年人留置导尿管中采集的标本（经常被三种以上细菌污染）尿液标本采集中段尿时要先用肥皂清洗女性的外阴和男性的外生殖器，然后用清水冲洗长期留置导尿管的患者应在更换新管时留取尿标本。做厌氧培养时应耻骨上膀胱穿刺采集尿。如不能及时送检，需冷藏（冷藏保存的标本不能用于淋病奈瑟菌培养）。4小时延迟送检，须废弃标本。评价尿培养的标准病人标本特征有意义菌落形成单位/ml（非皮肤污染）无症状者清洁留取100,000有症状者清洁留取10,0001-2种机会致病菌。若多于2种则认为尿液被污染有症状,女性清洁留取100个纯菌落肠杆菌科菌有症状,男性清洁留取1000个，机会致病菌任何人内置导尿管100,000任意数量机会致病菌任何人通过直接导管获得100任意数量机会致病菌任何人外科手术从肾脏获得任意数量（肉汤增菌，厌氧菌）任何人经皮穿刺膀胱吸取任意数量（肉汤增菌，厌氧菌）任何人任意标本任何数量金黄色葡萄球菌尿常规结果尿培养结果可能原因WBC－PRO－计数105无泌尿系统感染WBC+PRO+计数105重复送检，检查取样和保存条件是否符合要求，通知实验室为重复检查。WBC+PRO+计数105培养出一种致病菌预示患者泌尿系统感染。按药敏结果选择性用药。WBC+PRO+计数105培养出大于两种致病菌患者泌尿系统可能感染，但标本可能被污染，应重复送检。WBC++*/－PRO－计数105培养出大于两种致病菌标本污染粪便标本采集时间腹泻患者应在用药前、急性期采集；沙门菌感染、肠热症应在2周内采；厌氧菌出现症状即采集。采集方法自然排便采集标本时，取有脓血、粘液、组织碎片部分的粪便1-3g。液体粪便择取絮状物，1-3ml，直接装入无菌、带盖、广口的培养杯中送检，送检的标本中不能加入防腐剂。不易获得粪便患者及幼儿：用直肠拭子采集后置保存液或输送培养基中送检。粪便标本应尽快送检，室温条件下运送标本的时间不能超过2小时。如不能及时送检可加入pH7.0磷酸盐甘油缓冲保存液中或使用Cary-Blair运送培养基置于4°C冰箱保存，但保存时间不能超过24小时。直肠拭子采集的标本必须置入Cary-Blair运送培养基或GN肉汤中送检，室温运送时间不超过2小时，4°C冰箱保存时间不超过24小时。高度怀疑霍乱弧菌感染的标本运送必须符合特殊标本的安全要求微生物标本拒收原则实验室遇到下列情况标本时应拒绝接收，并及时通知采集标本的医生或护士，说明拒收原因，同