神经系统脱髓鞘动物模型的研究进展

中枢神经系统脱髓鞘动物模型的研究进展苏　乐　陈兴书△（第三军医大学组织学与胚胎学教研室，重庆４０００３８）摘要　中枢神经系统脱髓鞘后髓鞘再生困难，具体机制目前尚不清楚。选择恰当的脱髓鞘动物模型对于探索脱髓鞘和!鞘再生的机制十分重要。目前中枢神经系统脱髓鞘动物模型主要包括实验自身免疫性脑脊髓炎模型、毒素模型、病毒模型、转基因以及基因敲除模型。本文简要综述各种脱髓鞘动物模型的发病机制、应用和优缺点等方面的研究进展，以期为选择脱!鞘模型提供参考。关键词　中枢神经系统；脱髓鞘；动物模型中图分类号　Ｒ７４４．５　　中枢神经系统（ｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍ，ＣＮＳ）脱髓鞘疾病是发生在脑和脊髓中，以髓鞘破坏、炎性细胞浸润为主要病理特征的疾病。ＣＮＳ脱髓鞘疾病包括髓鞘形成障碍型和髓鞘破坏型两类。前者是指先天缺陷造成髓鞘形成不良或髓鞘形成不全，如脑白质营养不良。后者是指原发性或继发性因素造成髓鞘破坏。原发性脱髓鞘病病因不明，目前认为主要由免疫介导引起，包括多发性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＭＳ）、急性播散性脑脊髓炎（ａｃｕｔｅｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，ＡＤＥＭ）、弥漫性脑硬化、视神经脊髓炎等；继发性脱髓鞘病主要由全身性疾病引起，如早产儿脑室周围白质软化症（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｌｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ，ＰＶＬ）［１］。临床上ＣＮＳ脱髓鞘疾病以ＭＳ和视神经脊髓炎最为多见。目前中枢神经系统脱!鞘疾病尚无有效的治疗方法，主要原因在于脱髓鞘以及髓鞘再生的机制不清。近年来各种ＣＮＳ脱髓鞘疾病动物模型相继建立并逐渐完善，给脱髓鞘及髓鞘再生修复机制的研究提供了良好的实验基础。因此，本文将从动物选择、制作方法、发病机制、应用情况、优缺点等方面简要综述中枢神经系统脱髓鞘动物模型的研究进展，以期为研究者选择脱!鞘模型提供参考。一、实验自身免疫性脑脊髓炎模型实验自身免疫性脑脊髓炎（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，ＥＡＥ）的动物模型制备是用髓鞘糖蛋白（ｍｙｅｌｉｎｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＭＯＧ）、髓鞘蛋白脂蛋白（ｍｙｅｌｉｎｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄｐｒｏｔｅｉｎ，ＰＬＰ）、髓鞘相关糖蛋白（ｍｙｅｌｉｎａｓｓｏｃｉａｔｅｄｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＭＡＧ）等髓鞘成分免疫动物，在其ＣＮＳ产生炎症脱髓鞘反应。髓鞘抗原特异性ＣＤ４＋Ｔ细胞在ＥＡＥ的发病中起主导作用，新近发现Ｔｈ１７细胞在发病中也起到了促进炎症发生的重要作用（Ｔｏｓｈｉｍａｓａ等．２００８）。ＥＡＥ模型主要使用大鼠、小鼠，近年来灵长类动物的使用也逐渐增加［２，３］。ＥＡＥ模型主要包括以下几类［２］：（１）急性ＥＡＥ（ａｃｕｔｅＥＡＥ，ａＥＡＥ）：通过皮下注射完全弗氏佐剂（ｃｏｍｐｌｅｔｅＦｒｅｕｎｄ＇ｓａｄｊｕｖａｎｔ，ＣＦＡ）乳化的髓鞘蛋白免疫动物建立；（２）转移性ＥＡＥ（ｔｒａｎｓｆｅｒＥＡＥ，ｔＥＡＥ）：从被髓鞘蛋白抗原免疫的动物脾或淋巴结中把活性ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞分离出来，转移至正常动物体内建立；（３）慢性复发性ＥＡＥ（ｃｈｒｏｎｉｃｒｅｌａｐｓｉｎｇＥＡＥ，ｃｒＥＡＥ）：在ａＥＡＥ的基础上再注射环孢素Ａ完成建立；（４）抗体依赖性ＥＡＥ（ａｎｔｉｂｏｄｙｄｅｐｅｎｄｅｎｔＥＡＥ，ａｄＥＡＥ）：先用ａＥＡＥ的方法免疫动物，然后向动物注射髓鞘抗原特异性抗体。ａＥＡＥ和ｔＥＡＥ可出现髓鞘损伤，ｃｒＥＡＥ产生严重的脱!鞘反应，ａｄＥＡＥ产生的脱髓鞘最严重。神经功能评分标准被用来判断ＥＡＥ模型是否建立成功，常用五分评分法。０分：无症状。１分：动物尾部肌张力降低。２分：动物尾部麻痹＋后肢肌张力低。３分：尾麻痹＋后肢肌张力重度低。４分：尾麻痹＋四肢麻痹。５分：频死状态。然而在实际情况中，不同的实验动物和免疫蛋白使ＥＡＥ呈现国家自然科学基金（３１１００７７１）和重庆市自然科学基金（２０１１ｊｊＡ１００２９）资助课题第三军医大学学员旅九队，高原医学本科生△通讯作者·５１１·生理科学进展２０１２年第４３卷第２期出不同的脱髓鞘表现，同时神经功能评分标准较多，使ＥＡＥ模型评分标准至今尚未达到规范化和统一化。ＥＡＥ模型具有如下优点［３～５］：（１）ＥＡＥ与ＭＳ的病理特征基本一致，病灶散在于ＣＮＳ中，以脊髓、小脑、脑干最为显著；（２）ＥＡＥ能较好的模拟ＭＳ的炎症、免疫监视以及组织损伤等生物学效应；（３）ＥＡＥ促进了ＭＳ免疫调节治疗药物的发展。但是ＥＡＥ与ＭＳ在免疫调节和ＣＮＳ病理方面仍然存在如下差异［３～６］：（１）处于脱髓鞘瘢痕形成阶段的ＭＳ患者脑部没有出现典型的ＣＤ４＋Ｔｈｌ细胞浸润为主的炎症反应；（２）在ＭＳ病理过程中的各个阶段，占主导地位的Ｔ细胞亚群不是ＣＤ４＋Ｔ细胞，而是ＣＤ８＋Ｔ细胞；（３）一些预防或者改善ＥＡＥ的治疗方法，如采用ＩＦＮγ治疗或者ＴＮＦ拮抗疗法，对治疗ＭＳ无效甚至使ＭＳ病情恶化；（４）ＥＡＥ作为一类自身免疫模型具有自体免疫的特征，而ＭＳ并不完全满足这些特征。因此，ＥＡＥ更倾向于模拟ＡＤＥＭ而不是ＭＳ［４］。但根据目前的现状，ＥＡＥ对于ＭＳ发病机制和免疫调节药物的实验研究依旧非常重要。二、毒素模型毒素诱导脱髓鞘模型的建立有以下两种方式：（１）喂食动物毒性化学物质，毒性物质经血液循环通过血脑屏障在ＣＮＳ脑组织中作用于髓鞘或少突胶质细胞产生脱髓鞘反应；（２）人工注射毒性物质到动物大脑或脊髓，毒性物质在注射部位弥散发生脱髓鞘反应。毒素脱髓鞘模型常用的化学物质有Ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ、溴化乙锭（ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ，ＥＢ）和溶血卵磷脂（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，ＬＰＣ）。（一）Ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ模型　Ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ中文名为双环己酮草酰二腙，分子式为Ｃ１４Ｈ２２Ｎ４Ｏ２，是一种具有强烈刺激性和毒性的铜腙螯合物。Ｃ５７ＢＬ／６小鼠是制备Ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ模型发病率最高的品系［６，７］。使用混有０．２％Ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ的动物饲料喂养６～８周的小鼠即可建立Ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ模型。Ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ脱髓鞘模型可分为急性脱髓鞘模型和慢性脱髓鞘模型。急性脱髓鞘模型是用含Ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ的饲料喂养小鼠５～６周制备而成，但Ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ喂食６周后改喂养正常粮食髓鞘会自发性地修复。慢性脱髓鞘模型则需喂养至１２周，停止喂食Ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ后髓鞘仍然难以自发修复。制备Ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ脱髓鞘模型时使用４～６周龄的小鼠比６～８周龄的小鼠更容易脱!鞘，成年鼠和老年鼠的脱髓鞘不如幼龄鼠明显，但年龄太小死亡率大。文献报道［７］大剂量Ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ会导致小鼠死亡，０．５％Ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ对四周大的小鼠致死率可达１００％，对８周大的小鼠致死率也能达到２０％。小鼠体重在喂食Ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ初期呈正常上升，在３～４周脱髓鞘开始后呈下降趋势，小鼠在脱髓鞘过程中伴随着运动和行为能力的减退［７～９］。研究显示Ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ特异性作用于少突胶质谱系细胞，目前对于Ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ产生脱髓鞘的机制如下［２～８，１０］：（１）作用于少突胶质细胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ，ＯＬｓ），使其缺乏铜因而抑制线粒体内铜腙依赖的细胞色素氧化酶和单胺氧化酶的作用；（２）以增大或融合方式形成巨大线粒体，导致少突胶质细胞出现呼吸障碍和代谢障碍；（３）降低大脑碳酸酐酶Ⅱ水平，改变正常ｐＨ使少突胶质细胞发生应激导致细胞死亡；（４）抑制少突胶质前体细胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，ＯＰＣｓ）分化；（５）激活小胶质细胞巨噬细胞聚集在脱髓鞘区域分泌促炎症细胞因子。Ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ模型有以下优点［５，７，８，１１］：（１）脱髓鞘部位主要集中于皮质、胼胝体、小脑上脚和软膜下区域等；（２）Ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ作用于少突胶质谱系的细胞，而对神经元和星形胶质细胞的影响较小；（３）Ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ停药后恢复正常粮食喂养的小鼠髓鞘会再生修复；（４）给药方法简单，模型制作便捷。由于Ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ脱!鞘部位确定，容易重复，许多在基因敲除小鼠中进行的研究也使用Ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ模型［８］。然而Ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ模型与ＭＳ产生脱髓鞘的机制不同：普遍认为ＭＳ通过免疫Ｔ细胞介导炎症反应，而Ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ模型则是选择性损伤的结果。Ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ模型产生脱髓鞘时小鼠的血脑屏障（ｂｌｏｏｄｂｒａｉｎｂａｒｒｉｅｒ，ＢＢＢ）完整，制备Ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ模型的周期较长，这些都是制约Ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ模型运用的因素。因此Ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ模型主要用于研究局部脱髓鞘、髓鞘再生的机制以及抑制脱髓鞘和促进髓鞘再生的药物治疗试验［４］。（二）溴化乙锭模型　溴化乙锭模型最早是由Ｙａｊｉｍａ和Ｓｕｚｕｋｉ于１９７９年制备成功，他们直接将ＥＢ注射到大鼠脑中产生脱髓鞘。早期的ＥＢ模型制备是将ＥＢ注射至基底池或小脑延髓池，然后ＥＢ弥散至脑桥腹侧面的蛛网膜下腔中产生脱髓鞘，目前是直接将ＥＢ注射至白质束、脊髓后索、小脑下脚等部位产生脱髓鞘，ＥＢ溶液经典的注射剂量是０．０５％或０．１％［１１］。注射溴化乙锭２～４周后在目标区域及周边产生明显的炎症脱髓鞘，同时伴随少突胶质细胞的死亡（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ等．１９９７）。ＥＢ模型的优点主要是在中枢神经系统限定区域直接产生明·６１１·生理科学进展２０１２年第４３卷第２期显的炎性脱髓鞘，并自发性地同步出现髓鞘再生［４，５，１１］；缺点在于ＥＢ对脑组织产生创伤，损伤星形胶质细胞和ＯＰＣｓ等［４，５，１１］。（三）溶血卵磷脂模型　溶血卵磷脂是磷脂质的一种，也称溶血磷脂酰胆碱。它是磷脂酶Ａ２的激活剂，在大鼠ＣＮＳ特定部位注射溶血卵磷脂可以快速产生急性炎症脱髓鞘。脊髓胸腰平面背侧核与腹外侧核是最常用的注射部位，通常注射剂量为２μｌ的０．１％溶血卵磷脂溶液［１１，１２］。ＬＰＣ不通过免疫介导脱髓鞘，在免疫缺陷的小鼠中注射ＬＰＣ同样能产生脱髓鞘。但是在注射ＬＰＣ后的急性期内注射部位有Ｔ细胞、Ｂ细胞和巨噬细胞的浸润，这种短时的作用被认为有利于ＣＮＳ的修复［４］。溶血卵磷脂模型的优点基本同ＥＢ模型相似：在注射部位产生局部炎症脱髓鞘，同时伴随自发性地髓鞘再生。与ＥＢ不同的是，ＬＰＣ完全性地髓鞘再生要在５～６周之后。溶血卵磷脂模型的缺点是：注射ＬＰＣ部位产生脱髓鞘炎症的区域很小，ＬＰＣ对星形胶质细胞和轴突产生损伤［４，５，１１，１２］。三、病毒模型病毒介导的脱髓鞘模型与ＭＳ很相似，被广泛认为能较好模拟脱髓鞘疾病的发病过程。病毒模型发病机制可能如下［１３，１４］：（１）动物感染病毒后其ＣＮＳ少突胶质细胞的稳定性被破坏，引起髓鞘脱失最终导致细胞死亡；（２）病毒在少突胶质细胞中复制激活免疫反应，产生细胞因子发生针对髓鞘的特异性炎症损伤反应。（一）Ｔｈｅｉｌｅｒ鼠型脑炎病毒模型　Ｔｈｅｉｌｅｒ鼠型脑炎病毒（Ｔｈｅｉｌｅｒ＇ｓｍｕｒｉｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓｖｉｒｕｓ，ＴＭＥＶ）在ＣＮＳ脱髓鞘病毒模型中使用最多，ＴＭＥＶ介导的脱髓鞘反应中ＣＤ８＋Ｔ细胞和ＣＤ４＋Ｔ细胞发挥了重要的作用，较好的模拟脱髓鞘疾病ＭＳ的特征性病理改变。常用的ＴＭＥＶ主要有两类［４，１４］：一类是具有强神经毒性的ＧＤＶＩＩ变种品系，只引起急性炎症反应而不能使耐受动物出现持续性的长期慢性炎症。另一类是神经毒性较弱的Ｔｈｅｉｌｅｒ原种品系ＢｅＡｎ和ＤＡ，能引起慢性脱髓鞘炎症反应。ＢｅＡｎ和ＤＡ是建立ＴＭＥＶ模型最常用的病毒品系。使用ＢｅＡｎ和ＤＡ毒株制备的模型存在差异：注射ＢｅＡｎ品系的动物在３０～５０天后出现明显症状，而注射ＤＡ品系的动物则要在１４０～１８０天后出现。ＴＭＥＶ产生脱髓鞘具有以下特点［４，５，１３，１４］：（１）持续整个慢性疾病过程；（２）病理改变仅仅限于中枢神经系统；（３）对ＴＭＥＶ易感的小鼠中脊髓脱髓鞘和轴突损伤十分广泛；（４）小鼠脱髓鞘部位出现髓鞘自发性地修复；（５）一些非ＴＭＥＶ病毒被证实在人类中增加脱髓鞘疾病发生的风险。尽管ＴＭ