基因工程2006复习题

一、填空1、基因工程是（70）年代发展起来的遗传学的一个分支学科。基因工程技术的诞生，使人们从简单的利用现存的生物资源进行诸如发酵、酿酒、制醋和酱油等传统的生物技术时代走向（按人们的需要而定向地改造和创造具有新的遗传性品种）的时代。2、（1970）年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离得到一种限制酶，能够特异性的切割DNA，这个酶后来被命名为（HindII），这是第一个被分离到的II类限制性内切核酸酶。4、pBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于（pMB1），它的四环素抗性基因来自于（pSC101），它的氨苄青霉素抗性基因来自于（pSF2124（R质粒））。6、在分离DNA时要使用金属离子螯合剂，如EDTA和柠檬酸钠等，其目的是（螯合Mg2+离子，抑制核酸酶的活性）。7、Northern印迹和Southern印迹有两点根本的区别：1)（印迹的对象不同：Northern是RNA，Southern是DNA；）；2)（电泳条件不同，前者是变性条件，后者是非变性条件）。8、PCR扩增筛选重组体是比较简便的筛选方法，它适合于（插入外源片段的种类较多，大小又极为相似的重组体的筛选）。9、乙醇沉淀DNA的原理是（乙醇使DNA分子脱水）。10、引物在基因工程中至少有4个方面的用途：1)（合成探针）；2)（合成cDNA）；3)（用于PCR反应）；4)（进行序列分析）。11、野生型M13有10个基因，分为三个功能集团，其中与复制有关的两个基因是（基因Ⅱ）和（基因Ⅴ）。13、重组体的筛选有两层涵义，一是将（携带有外源插入DNA片段的克隆挑选出来）；二是将（携带有特定外源插入片段的重组体挑选出来）。14、产生平末端的方法通常有：1）（平切的酶）；2）（S1核酸酶切除粘性末端）；3）（DNA聚合酶补平粘末端）。13、15、通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的（限制性酶切图谱）。16、部分酶切可采取的措施有：1)（减少酶量）；2)（缩短反应时间）；3)（增大反应体积）等。18、假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件：1)（保持正确的可读框）；2)（能够使其转录的启动子）；3)（具有翻译的起始和终止信号）。14、受体细胞的感受态是（接受外源DNA的生理状态。）。19、DNA重组连接的方法大致分为四种：1）（粘性末端连接）；2）（平末端连接）；3）（同聚物接尾连接）；4）（接头连接法）。15、限制性内切核酸酶通常保存在（50%）浓度的甘油溶液中。24、为了防止DNA的自身环化，可用（碱性磷酸酶）去双链DNA（5’端的磷酸基团）。16、25、就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：（复制区：含有复制起点）、（选择标记：主要是抗性基因）、（克隆位点：便于外源DNA的插入）。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。27、克隆基因的主要目的有四：1）（扩增DNA）；2）（获得基因产物）；3）（研究基因表达调控）；4）（改良生物的遗传性。）。29、噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是（它在细菌中能够大量繁殖，这样有利于外源DNA的扩增）；二是（对某些噬菌体的遗传结构和功能研究的比较清楚，其大肠杆菌宿主系统的遗传也研究的比较详尽。）。30、在分离质粒DNA的菌体培养过程中，加入氯霉素有两个好处：1）（可以扩增质粒DNA）；2）（抑制了菌体的数量，有利于裂解）。31、基因工程是（70）年代发展起来的遗传学的一个分支学科。32、限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自（属名的第一个字母），第二、三两个字母取自（种名的前两个字母），第四个字母则用（株名）33、野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是（没有合适的限制性内切核酸酶识别位点）和（选择标记）。36、根据Northern杂交的结果可以说明：（外源基因是否进行了转录）。37、M13单链噬菌体的复制分为三个阶段1）（SS—RF）；2）（RF—RF）；3）（RF—SS）。38、酚是蛋白变性剂，用酚抽提细胞DNA时，具有两方面的作用：1）（使蛋白质变性）；2）（由于它能使蛋白质变性，故也能使核小体和核糖体解聚，释放出DNA和RNA，提高DNA的得率）。41、基因工程的两个基本特点是：1)（分子水平上的操作；），2)（细胞水平上的表达；）。43、（1970）年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离得到一种限制酶，能够特异性的切割DNA，这个酶后来被命名为（HindII），这是第一个被分离到的II类限制性内切核酸酶。44、基因工程中有3种主要类型的载体：（质粒DNA）、（病毒DNA）、（质粒和病毒DNA杂合体）。45、随着基因工程技术的诞生和发展，人类可以通过（细菌发酵）、（真核细胞培养）和（乳腺生物反应器）等三种主要生产方式，大量取得过去只能从组织中提取的珍稀蛋白，用于研究和治病。46、部分酶切可采取的措施有：（１）（减少酶量）；２）（缩短反应时间）；３）（增大反应体积）。47、为了防止DNA的自身环化，可用（碱性磷酸酶）脱去双链DNA（５’端的磷酸基团）。48、人工感受态的大肠杆菌细胞在温度为（０℃）时吸附DNA,温度为４２℃）时摄入DNA。49、基因克隆中三个基本要点是：（克隆基因的类型）；（受体的选择）和（载体的选择）。50、EDTA是（Ca2+）离子螯合剂。51、欲将某一具有突出单链末端的双链DNA分子转变成平末端的双链形式，通常可采用（S1核酸酶切割）或（DNA聚合酶补平）。52、目前，在重组体的筛选中，已经发展了许多构思巧妙、具有极高准确性的筛选方法。大致可以分为：1)（遗传学方法）；2)（物理筛选法）；3)（核酸杂交法）；4)（表达产物分析法）等。53、只要知道基因组中某一特定区域的部分核苷酸组成，用（PCR）可以将这段DNA进行百万倍的扩增。54、有两类改造型的λ噬菌体载体，即插入型和取代型。从酶切点看，插入型为（1）个，取代型为（2）个。55、M13噬菌体基因2和基因4之间的IG区有三个最重要的功能，即（1）（正链复制起点）；2）（负链复制起点）；3）（包装信号）。60、Clark发现用TaqDNA聚合酶得到的PCR反应产物不是平末端，而是有一个突出碱基末端的双链DNA分子。根据这一发现设计了克隆PCR产物的（T—载体）。61、DNA重组连接的方法大致分为四种：(1)（黏性末端连接）；2)（平末端连接）；3)（同聚物接尾连接）；4)（接头连接）。63、噬菌粒载体是一类由（丝状噬菌体DNA复制起始位点序列）与（质粒）组成的杂合分子。64、基因工程操作的三大基本元件是（供体）、（受体）和（载体。）。65、基因文库的构建方法包括（cDNA法）和（鸟枪法）。66、噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是（它在细菌中能够大量繁殖，这样有利于外源DNA的扩增）；二是（对某些噬菌体(如噬菌)的遗传结构和功能研究得比较清楚，其大肠杆菌宿主系统的遗传也研究得比较详尽）。71、在（Southern印迹）技术中，DNA限制性片段经凝胶电泳分离后，被转移到硝酸纤维素膜(或尼龙膜)上，然后与放射性的DNA探针杂交。基因工程的定义：在体外将核酸分子插入病毒,质粒或其它载体系统中,构成遗传物质的新组合再整合到那些本来不含该类物质的宿主中，从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。、Clone:从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。基因工程的特征：跨物种性——外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。无性扩增——外源DNA在寄主细胞内可大量扩增，和高水平表达。基因工程的主要操作内容：目的基因的获取——从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。重组体的制备——将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。重组体的转化——将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。克隆鉴定——挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。目的基因表达——使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。三大基本元件：供体、受体、载体。基因工程诞生了：Berg的开创性实验——1972年斯坦福大学的PaulBerg小组完成了首次体外重组实验：将SV40的DNA体的DNA片断连接起来。基因工程的安全隐患：对环境的影响——重新组合一种在自然见尚未发现的的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响。新型病毒的出现——制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播。癌症扩散——将肿瘤病毒或其它动物病毒的DNA引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。人造生物扩散——新组成的重组DNA生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险。实验室的物理安全：P1级实验室——一般装备良好的普通微生物实验室。②P2级实验室——在P1级实验室的基础上还装备有负压的安全操作柜。P3级实验室——全负压的实验室，同时装备安全操作柜。P4级实验室——专用的实验大楼，周围与其它建筑物应有隔离带。具有最高安全防护措施。大肠杆菌：EK1级的大肠杆菌——在自然环境中一般都要死亡。EK2-EK3级大肠杆菌——在自然环境中无法存活。一碱抽提法：原理：闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。所用的试剂作用：溶菌酶——能-1，4糖苷键。在碱性条件（pH8）下有活性。葡萄糖——增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。EDTA——Mg2+、Ca2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。NaOH-SD——NaOH：强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。SDS:溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。NaAc-HAc缓冲液——冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。用来中和NaOH变性液，使DNA复性。高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。乙醇——用于沉淀DNA（DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境）。RNaseA——降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。TE缓冲液——DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制（ris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲液），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解）。酚-氯仿——蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在DNA溶液中。（现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。影响质粒DNA产量的因素：受体菌株，质粒拷贝数（这是直接决定DNA产量的重要因素之一，质粒本身的性质所决定），质粒大小（分子量大的质粒，拷贝数少）。电泳时质粒DNA速度：闭合环状卷曲超螺旋线性分子伸展开环状琼脂糖凝胶的分辨力:空隙小，分辨率高：小分子较易通过，而大分子难通过；空隙大，分辨率低：大小分子几乎以同等速率通过。EB染色原理：EB是扁平分子，能插入DNA碱基之间，但不与琼脂糖结合。EB在300nm紫外光照射下能发红色荧光，即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置。荧光强度与DNA含量及大小成正比。核酸的分子杂交指：分子杂交技术是分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用于检测待测混合样品中特定的核酸或蛋白质等生物分子是否存在、存在的具体部位、含量的高低，以及其相对分子质量大小本生物信息。分子杂交技术原理：分子杂交是指在DNA变形后，在复性的过程中两个不同来源的，但同源的核酸分子形成杂合双