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植物组织培养植物体细胞杂交1.动物细胞培养2.动物细胞融合3.制备单克隆抗体4.细胞核移植回顾：动物细胞工程常用的技术手段：植物细胞工程常用的技术手段有哪些？动物细胞工程的基础就是从动物机体中取出相关组织，将它分散成单个细胞，然后,放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。1、动物细胞培养概念：2、原理：细胞增殖定义：人们通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养。胰蛋白酶处理取出组织胚胎或幼龄动物器官组织剪碎单个细胞细胞悬液转入培养瓶内培养（贴壁生长长成单层细胞。有接触抑制现象）。①原代培养3、过程原代培养增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养去掉组织间蛋白加培养液强调一：细胞贴壁过程■细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。■培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于帖附。■当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。强调二：接触抑制细胞的接触抑制定义：当原代培养的细胞处于接触抑制后,用胰蛋白酶处理,使细胞从瓶壁上脱离下来,然后加入新的培养液,将细胞分离稀释,并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内,这个过程称传代培养.（分瓶培养的过程）②传代培养遗传物质未改变原代细胞40—50代细胞(细胞株)遗传物质己改变无限传代（细胞系）分瓶传代培养胰蛋白酶原代培养接触抑制传代培养细胞株：传代细胞一般能传到40-50代，遗传物质一般不会发生改变，叫细胞株。强调：细胞株、细胞系（了解即可，老课本体系）细胞系：传代50代以后又出现细胞生长停滞状态，部分细胞遗传物质发生了改变，能连续传代，获得不死性，叫细胞系。▲细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。接触抑制总结：动物细胞培养过程动物胚胎或幼龄动物的组织、器官配置细胞悬液剪碎用胰蛋白酶处理10代细胞转入培养瓶40-50代细胞传代培养无限传代单个细胞加培养液稀释传代10代以内，遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。传代10-50代左右，增长缓慢以至于完全停止，部分细胞核型可能发生变化（遗传物质可能改变）为什么用胰蛋白酶处理？分瓶传代培养原代培养特点：细胞贴壁、接触抑制继续传代培养少部分细胞获得不死性，细胞突变，遗传物质已经改变，等同于癌细胞。细胞株：一般说遗传物质未改变细胞系：遗传物质已改变原代培养多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中据此思考：1.内环境稳态包括呢些方面？适宜的温度、pH值、渗透压、营养、氧气。2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？无菌、无毒的环境。3.体外培养细胞时需要提供哪些物质？如何才能保证类似于内环境的营养环境？培养基应是液态还是固态？充足的营养、适宜的温度、pH和气体环境。加入动物血清。培养基应是液态。思考：动物血清的作用？主要是：提供有利于细胞生长增殖所需的激素、生长因子或提供合成培养基所缺乏的营养物质等。保证细胞顺利的生长增殖4、动物细胞培养条件能否用胃蛋白酶代替胰蛋白酶？无菌、无毒的环境（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）营养（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清、微量元素等）温度和PH温度36.5+0.5度，pH7.2～7.4气体环境O2和CO2（95%空气和5%CO2）离体培养的细胞对微生物和有毒物质没有防御能力。保证细胞顺利的生长增殖动物细胞培养液的主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。动物培养基特有的特点是：（1）液体培养基（2）含有动物血清动物体细胞大都生活在液体的环境植物组织培养呢？无机盐、蔗糖、维生素、生长调节物质、植物激素成分比较：5.动物细胞培养技术的应用:1.蛋白质生物制品的生产如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体2.应用于基因工程主要用于作为受体细胞3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性4.细胞的生理、药理、病理研究如用于筛选抗癌药物1、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是--------------------（）A．细胞系B．细胞株C．原代细胞D．传代细胞2、动物细胞工程技术的基础是------（）A.动物细胞融合B.单克隆抗体C.胚胎移植D.动物细胞培养AD课堂反馈练习3、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞（）A.容易产生各种变异B具有更强的全能性C.取材十分方便D分裂增殖的能力强D4、下列属于动物细胞工程中的工具是（）A．限制性内切酶B．DNA连接酶C．胰蛋白酶D．果胶酶C9、下图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据此图回答(1)容器A中放置的是动物器官或组织。它一般取自___________。(2)容器A中的动物器官或组织首先要进行的处理是__________，然后用酶处理，这是为了使细胞分散开来。这样做的目的是_______________.(3)培养首先在B瓶中进行。瓶中的培养基成分有__________等。在此瓶中培养一段时间后，有许多细胞衰老死亡，到这时的培养称为___________.(4)为了把B瓶中的细胞分装到C瓶中，用_____处理，然后配置成___________，再分装。(5)在C瓶中正常培养了一段时间后，发现细胞全部死亡。原因是_________________________。幼龄动物的器官或组织、动物胚胎用剪刀剪碎胰蛋白使每个细胞能与培养液接触，便于获取营养和排出代谢废物葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清原代培养胰蛋白酶细胞悬浮液细胞没有发生癌变细胞的全能性细胞株、细胞系植物体或组织培养结果获得细胞或细胞分泌蛋白快速繁殖、培育无病毒植株等培养目的葡萄糖、动物血清蔗糖、植物激素培养基特有成分液体培养基固体培养基培养基性质细胞增殖原理动物细胞培养植物组织培养比较项目植物组织培养和动物细胞培养的比较细胞分化程度，恢复全能性。核移植（难度高）三、动物体细胞核移植技术胚胎细胞核移植体细胞核移植细胞分化程度，恢复全能性。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物1.概念：将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。低容易高困难卵母细胞黑面母绵羊白面母绵羊乳腺细胞细胞核移植早期胚胎C母绵羊子宫胚胎移植多莉羊分娩妊娠融合后的卵母细胞2.体细胞核移植过程◆取供体细胞传代培养10代以内的细胞.为什么？◆用的是去核的减数第二次分裂中期细胞（MⅡ中期）为什么？◆激活方法：◆激活目的：◆促融方法：电刺激◆胚胎移植至代孕受体内妊娠、分娩体细胞核移植流程供体：优质高产奶牛受体：普通奶牛（卵母细胞的采集与培养）1.体积大，易操作。2.含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。有人说它三个母亲，对吗？细胞核核移植电激处理使供体核进入受体卵母细胞构建重组胚胎卵母细胞采集、培养MⅡ期卵母细胞供体牛供体细胞注入去核卵母细胞代孕母牛克隆牛体细胞培养去核卵母细胞去核胚胎移植体细胞核移植过程（体细胞克隆动物）１、核移植之前，为何要去掉受体卵母细胞的核？为使核移植动物的核遗传物质全部来自有利用价值的动物提供的细胞。２、用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，为什么？10代以内的细胞保持一般保持正常二倍体的核型3、细胞核移植生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？不是，克隆动物绝大部分DNA来自供体细胞核，但核外还有少部分DNA（如线粒体DNA）来自受体卵母细胞。在体细胞克隆羊“多莉”培育成功之前，胚胎细胞核移植技术已经有了很大的发展。实际上，“多莉”的克隆在核移植技术上沿袭了胚胎细胞核移植的全部过程，但这并不能减低“多莉”的重大意义，因为它是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物，是克隆技术领域研究的巨大突破。这一巨大进展意味着：在理论上证明了，同植物细胞一样，分化了的动物细胞核也具有全能性．4.动物克隆实例很多，为何多莉就举世闻名呢？2.体细胞核移植技术的应用前景你还在为身体有残疾而苦恼吗？你还在为器官移植找不到合适的供体而焦虑吗？不能在这样下去了，看看我们的体细胞核移植技术吧，只需要从你身上取一个小小的体细胞，通过核移植培养出胚胎干细胞，再用胚胎干细胞诱导分化出各种组织器官，这样的器官的组织相容性抗原跟你的一摸一样，用这样的器官进行器官移植，根本就不会发生免疫排斥。不夸张的说，如果这项技术研究成熟了，以后大家换条胳膊换条腿就跟给汽车换个轮胎一样。你听明白了吗？这不是天方夜谭，巨大的前景就在眼前，你还在等什么？现在，对，就是现在，赶紧加入到生命科学的研究中来吧！广而告之：四、体细胞核移植技术的应用前景1、加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育2、保护濒危物种，增加存活数量3、克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白4、可以作为异种移植的供体，可以用于组织器官的移植五、体细胞核移植技术存在的问题•胚胎移植－动物幼体产出概率＜10％•克隆动物存在着健康问题•克隆动物的食品安全性问题存在争议1．(2009年浙江理综)用动、植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是()A．都需用CO2培养箱B．都需用液体培养基C．都要在无菌条件下进行D．都可体现细胞的全能性解析：用动、植物成体的体细胞进行离体培养都必须在无菌条件下进行。用植物成体的体细胞进行离体培养获得新个体体现的是细胞的全能性，而动物体细胞离体培养主要是获得细胞的代谢产物。答案：C7、(2008年宁夏高考)回答下列有关动物细胞培养的问题：(1)在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面___________时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的___________。此时，瓶壁上形成的细胞层数是________。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的酶是________________。(2)随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现_______________的现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成________细胞，该种细胞的黏着性________，细胞膜表面蛋白质(糖蛋白)的量___________。相互接触接触抑制胰岛蛋白酶单层减少不死性降低衰老甚至死亡(3)现用某种大分子染料，对细胞进行染色时，观察到死细胞被染色，而活细胞不染色，原因是______________________________________________(4)检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最好选用细胞分裂到________期的细胞用显微镜进行观察。(5)在细胞培养过程中，通常在________条件下保存细胞。因为在这种条件下，细胞中________的活性降低，细胞______________的速率降低。(6)给患者移植经细胞培养形成的皮肤组织后，发生了排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤组织当作________进行攻击。酶由于死细胞的膜丧失了选择透过性，大分子染料能够进入死细胞内而着色中超低温新陈代谢抗原6．(海南高考)某研究小组进行药物试验时，以动物肝细胞为材料，测定药物对体外培养细胞的毒性。供培养的细胞有甲、乙两种，甲细胞为肝肿瘤细胞，乙细胞为正常肝细胞。请回答下列有关动物细胞培养的问题：(1)将数量相等的甲细胞和乙细胞分别置于培养瓶中培养，培养液及其他培养条件均相同。一段时间后，观察到甲细胞数量比乙细胞数量________。(2)在动物细胞培养时，通常在合成培养基中加入适量血清，其原因是____________________________________，细胞培养应在含5%CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是_____________________。血清可以补充合成培养基中缺乏的物质维持培养液pH多(3)在两种细胞生长过程中，当乙细胞铺满瓶壁时，其生长________。药物试验需要大量细胞，两种细胞频繁传代，甲细胞比乙细胞可以传代的次数更______。若用动物的肝脏组织块制备肝细胞悬液，需用____________消化处理。(4)为了防止细胞培养过程中细菌的污染，可向培养液中加入