生物化学及分子生物学(人卫第九版)-14-RNA的合成

作者:张玉祥闫晓东单位:首都医科大学第十四章RNA的合成目录第一节原核生物转录的模板和酶第二节原核生物的转录过程第三节真核生物RNA的合成第四节真核生物RNA前体的加工和降解重点难点熟悉了解掌握RNA转录的模板和酶；真核生物的转录后加工转录过程；原核和真核生物转录的异同内含子的种类；RNA的降解机制转录(transcription)是生物体以DNA为模板合成RNA的过程转录RNADNA在生物界，RNA合成有两种方式：一是DNA指导的RNA合成，也叫转录，此为生物体内的主要合成方式，也是本章介绍的主要内容。转录产物除mRNA、rRNA和tRNA外，在真核细胞内还有snRNA、miRNA等非编码RNA。另一种是RNA指导的RNA合成(RNA-dependentRNAsynthesis)，也叫RNA复制(RNAreplication),由RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase)催化，常见于病毒，是逆转录病毒以外的RNA病毒在宿主细胞以病毒的单链RNA为模板合成RNA的方式。原核生物转录的模板和酶第一节参与转录的物质：原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA酶:RNA聚合酶(RNApolymerase,RNA-pol)其他蛋白质因子及Mg2+和Mn2+等合成方向5→3，核苷酸间的连接方式为3，5-磷酸二酯键。一、原核生物转录的模板结构基因：DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因(structuralgene)。模板链和编码链：在DNA分子双链上，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录；模板链并非总是在同一单链上。5335模板链编码链编码链模板链转录方向转录方向5′···GCAGTACATGTC···3′3′···cgtgatgtacag···5′5′···GCAGUACAUGUC···3′N······Ala·Val·His·Val······C编码链模板链mRNA蛋白质转录翻译DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链(templatestrand)，也称作有意义链或Watson链。相对的另一股单链是编码链(codingstrand)，也称为反义链或Crick链。模板链和编码链（一）RNA聚合酶能从头启动RNA链的合成二、RNA聚合酶催化RNA合成(NMP)n+NTP→(NMP)n+1+PPiRNA延长的RNADNA依赖的RNA聚合酶催化RNA合成的机制RNA聚合酶和双链DNA结合时活性最高，但是只以双链DNA中的一股DNA链为模板。RNA聚合酶和DNA的特殊序列——启动子(promoter)结合后，就能启动RNA合成。DNA聚合酶在启动DNA链延长时需要引物存在，而RNA聚合酶不需要引物就能直接启动RNA链的延长。（二）RNApol由多个亚基组成核心酶全酶表14-1大肠杆菌RNA聚合酶组分亚基分子量每分子酶中所含数目功能α365122决定哪些基因被转录β1506181与转录全过程有关（催化）β′1556131结合DNA模板（开链）β′折叠和稳定性；σ募集σ702631辨认起始点大肠杆菌内有一些不同的RNApol全酶，其差异是σ亚基的不同。目前已发现多种σ亚基，并用其分子量命名区别，最常见的是σ70（分子量70kDa）。σ70是辨认典型转录起始点的蛋白质，大肠杆菌中的绝大多数启动子可被含有σ70因子的全酶所识别并激活。但有些基因的启动子，如热激蛋白（heatshockproteins,Hsp）也为另外的σ亚基（σ32）识别。三、RNA聚合酶结合到DNA的启动子上启动转录转录是不连续、分区段进行的。每一转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)。操纵子包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。5335结构基因调控序列RNA-polRNA聚合酶保护法调控序列中的启动子是RNA聚合酶结合模板DNA的部位，也是控制转录的关键部位。原核生物以RNA聚合酶全酶结合到DNA的启动子上启动转录，其中由σ亚基辨认启动子，其他亚基相互配合。开始转录TTGACAAACTGT-35区(Pribnowbox)TATAATPuATATTAPy-10区1-30-5010-10-40-205335RNA-pol辨认位点(recognitionsite)55RNA聚合酶保护区结构基因33原核生物的转录过程第二节原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA酶:RNA聚合酶(RNApolymerase,RNA-pol)其他蛋白质因子及Mg2+和Mn2+等合成方向5→3，核苷酸间的连接方式为3，5-磷酸二酯键。原核生物的转录过程可分为转录起始、转录延长和转录终止三个阶段。参与转录的物质：原核生物转录过程和参与转录的物质RNApol必须准确地结合在转录模板的起始区域。DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。一、转录起始需要RNApol全酶转录起始需解决两个问题：2.DNA双链打开，形成开放转录复合体(opentranscriptioncomplex)；DNA分子接近-10区域的部分双螺旋解开后转录开始。DNA双链解开的范围只在17bp左右，这比复制中形成的复制叉小得多。1.RNA聚合酶全酶(2)识别并结合启动子，形成闭合转录复合体（closedtranscriptioncomple）；3.在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成第一个磷酸二酯键：RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH3转录起始复合物:5-pppG-OH+NTP5-pppGpN-OH3+ppi转录起始过程E.coli的转录起始和延长第一个磷酸二酯键生成后，转录复合体的构象发生改变，σ亚基即从转录起始复合物上脱落，核心酶连同四磷酸二核苷酸，继续结合于DNA模板上，酶沿DNA链前移，进入延长阶段。有些时候转录起始会发生流产式起始的情况。二、RNApol核心酶独立延长RNA链1.亚基脱落，RNA–pol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；2.在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi大肠杆菌的转录泡局部结构示意图转录空泡(transcriptionbubble)：RNA-pol（核心酶）····DNA····RNA转录延长有以下特点①核心酶负责RNA链延长反应；②RNA链从5-端向3-端延长，新的核苷酸都是加到3-OH上；③对DNA模板链的阅读方向是3-端向5-端，合成的RNA链与之呈反向互补，即酶是沿着模板链的3向5方向或沿着编码链的5向3方向前进的；④合成区域存在着动态变化的8bp的RNA-DNA杂合双链；⑤模板DNA的双螺旋结构随着核心酶的移动发生解链和再复合的动态变化。转录过程中DNA的超螺旋结构变化三、原核生物转录延长与蛋白质的翻译同时进行53DNA核糖体RNARNA聚合酶在同一DNA模板上，有多个转录同时在进行；转录尚未完成，翻译已在进行。因子是由相同亚基组成的六聚体蛋白质，亚基分子量46kD。因子能结合RNA，又以对polyC的结合力最强，但对polydC/dG组成的DNA的结合能力就低得多。因子还有ATP酶活性和解螺旋酶(helicase)的活性。（一）依赖因子的转录终止四、原核生物转录终止分为依赖ρ因子与非依赖ρ因子两大类（二）非依赖因子的转录终止DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。茎环结构使转录终止的机制:使RNA聚合酶变构，转录停顿；局部RNA/DNA杂化短链的碱基配对是最不稳定的。RNA链上的多聚U也是促使RNA链从模板上脱落的重要因素。真核生物RNA的合成第三节种类ⅠⅡⅢ转录产物rRNA的前体45SrRNAmRNA前体hnRNA,lncRNA,piRNA,miRNAtRNA,5SrRNAsnRNA对鹅膏蕈碱的反应耐受敏感高浓度下敏感细胞内定位核仁核内核内一、真核生物至少有三种DNA依赖的RNA聚合酶RNA聚合酶Ⅱ由12个亚基组成，其最大的亚基称为RBP1。RNA聚合酶Ⅱ最大亚基的羧基末端有一段共有序列(consensussequence)为Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser的重复序列片段，称为羧基末端结构域(carboxyl-terminaldomain,CTD)。CTD对于维持细胞的活性是必需的。RNApolⅡ是真核生物中最活跃、最重要的酶，故本章叙述的真核生物的转录主要以RNApolⅡ所催化的转录反应为例。真核生物RNA聚合酶的组成不同RNA聚合酶使用不同类型的启动子二、转录因子在真核生物转录起始中具有重要作用真核生物的基因转录过程，同样可以分为3个阶段：起始阶段（RNApol和通用转录因子形成转录起始复合体）、延长阶段和转录终止。与原核生物的显著不同是，起始和延长过程都需要众多相关的蛋白质因子参与，这些因子被称为转录因子（transcriptionalfactors,TF）或反式作用因子（trans-actingfactors）。真核生物转录起始也需要RNApol对起始点上游DNA序列进行辨认和结合，生成转录前起始复合体（preinitiationcomplex,PIC）。转录起始时，真核生物的RNApol不直接识别和结合模板的起始区，而是依靠转录因子识别并结合起始序列，故其起始复合体的装配过程比原核生物复杂的多。能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-actingfactors)。反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为通用转录因子（generaltranscriptionfactor）或基本转录因子（basaltranscriptionfactor）。（一）转录前起始复合体的形成参与RNA-polⅡ转录的TFⅡ的作用转录因子功能TFⅡDTBP亚基结合TATA盒TFⅡA辅助TBP-DNA结合TFⅡB稳定TFⅡD-DNA复合物，结合RNApolTFⅡE解螺旋酶,结合TFⅡHTFⅡF促进RNApolⅡ结合及作为其他因子结合的桥梁TFⅡH解旋酶、作为蛋白激酶催化CTD磷酸化真核生物中不同的RNApol需要不同的基本转录因子（TF）配合完成转录的起始和延长。相对应于RNApolI、RNApolII、RNApolIII，这些TF分别称为TFI、TFII、TFIII。真核RNA聚合酶Ⅱ与通用转录因子的作用过程①由TFIID中的TBP识别TATA盒，并在TAFs的协助下结合到启动子区，然后TFIIB与TBP结合，同时TFIIB也能与DNA结合，TFIIA可以稳定与DNA结合的TFIIB-TBP复合体；②TFIIB-TBP复合体与RNApolII-TFIIF复合体结合，此举可降低RNApolII与DNA的非特异部位的结合，协助RNApolII靶向结合启动子；③TFIIE和TFIIH加入，形成闭合复合体，装配完成。闭合转录复合体的形成步骤TFIIH具有解旋酶（helicase）活性，能使转录起点附近的DNA双螺旋解开，使闭合转录复合体成为开放转录复合体，启动转录。TFIIH还具有激酶活性，它的一个亚基能使RNApolII的CTD磷酸化。CTD磷酸化能使开放复合体的构象发生改变，启动转录。CTD磷酸化在转录延长期也很重要，而且影响转录后加工过程中转录复合体和参与加工的酶之间的相互作用。当合成一段含有60～70个核苷酸的RNA时，TFIIE和TFIIH释放，RNApolII进入转录延长期。此后，大多数的