RT-QPCR

华大医学我的基因我知道我的健康我做主Real-timeqPCRRel-timeqPCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时观测。由于PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的工具。目前应用领域：基因的差异表达分析、SNP检测、等位基因检测、药物开发、临床诊断、转基因研究等等。realtimePCR的扩增曲线◇基线（Baseline）是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基线。◇荧光阈值threshold的设定一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值是PCR3-15个循环的荧光信号标准偏差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。◇CT值表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。几个概念Ct值极具重现性PE公司在同一台PCR仪上对相同模板进行96次扩增的扩增曲线图Ct与初始模板的关系固定循环数后，荧光信号与模板数成正比固定荧光信号值后，模板数就与循环数成反比初始DNA量越多,荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct值)越少起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量0.000.501.001.502.002.503.001416182022242628303234363840CycleΔRnThreshold104103102模板定量有两种策略；相对定量和绝对定量。相对定量指的是在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化。绝对定量指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本的量。2.标准曲线法的相对定量，由于在此方法中对目的基因的是相对于某个参照物的量而言的，因此相对定量的标准曲线就比较容易制备，对于所用的标准品只要知道其相对稀释度即可。在整个实验中样本的靶序列的量来自于标准曲线，最终必须除以参照物的量。在实验中为了标准化加入反应体系的RNA或DNA的量，往往在反应中同时扩增一内源控制物，如在基因表达研究中，内源控制物常为一些看家基因（如beta-actin,3-磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH等）模板定量有两种策略；相对定量和绝对定量。相对定量指的是在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化。绝对定量指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本的量。1.标准曲线法的绝对定量，此方法是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒DNA，体外转录的RNA，或者是体外合成的ssDNA。标准品的量可根据260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量来转换成其拷贝数来确定。目的基因与标准品在不同的反应管内同时进行扩增。如何设计荧光定量PCR实验方案根据拟要研究的基因名称，在genebank中找到相应的基因序列（）采用引物设计软件PrimerExpress2.0(Taqman探针或SYBRGreenI，说明见)和beacondesigns3.0进行引物探针的设计软件可在下载PCR产物大小在50-150bp引物设计原则•在探针确定以后再选择引物•引物要尽可能地接近探针，但是不要重叠•保持G-C含量在30-80%之间•避免同一碱基重复过多。特别是G，不可超过4个及以上•用PrimerExpress软件计算出来的Tm值应当在58-60℃之间•3’的5个碱基中G和/或C碱基的总数不能超过2个TaqMan探针设计原则•保持G-C含量在30-80%之间•避免同一碱基重复过多。特别是G，不可超过4个及以上•5’不能是G•尽量使探针中的C多于G•上述两条如果不能满足，则使用互补链上的探针•对于单探针反应，用PrimerExpress软件计算出来的Tm值应当在68-70℃之间，比引物高10℃。长度30bp如何设计荧光定量PCR实验方案不加探针的常规PCR反应，验证引物是否合适、模板是否降解、模板纯度是否合适。同时确定最佳反应体系和反应条件每次实验都设置阴性对照和标准品，每个样品设两个平行孔数据分析——基线和阈值的设定确定正确的基线设定合适的阈值•注意：同样的实验最好使用同样的基线和阈值，这样可以增加实验的准确性、重复性。但是阈值和基线不能被保存，因此必须记录基线的缺省值在3～15循环阈值的缺省值是基线范围内荧光信号强度标准偏差的10倍双击Y轴，将图转化为线图，确定最先出现的反应是否出现在15个循环后，如果是出现在15个循环后，那么不需要调整基线高丰度靶基因经常在PCR循环早期开始扩增需要调整基线的循环终止值不正确的基线设置基线终止循环数太低基线终止循环数太高阈值的缺省值是基线荧光信号强度标准偏差的10倍可以将阈值线的光标移到符合下列条件的扩增曲线的位置：指数扩增的线性阶段精度最大敏感性最大常用的荧光定量PCR试剂SYBRGreenITaqman水解探针分子信标SYBRGreenI结合到双链DNA的小沟部位只有和双链DNA结合后才发荧光SYBRGreenI工作原理未结合的SYBRgreenISYBRGreenI的特点可以用于不同的模板使用方便，价格相对便宜灵敏度很高与非特异性产物结合解离曲线选择良好的引物和探针并优化反应条件结合解离曲线识别不同的PCR产物95℃15sec;60℃20sec;95℃15sec在60℃～95℃之间的Ramptime设为19:59TaqManProbes荧光素淬灭剂与目标序列互补FAMTETJOEHEXVICTAMRADABCYLTaqManProbes工作原理探针与目标序列配对时，发生FRET光能量转移Taq游离的探针荧光基团淬灭剂延伸时，Taq酶水解探针，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发出荧光，形成荧光信号Taq发出荧光光另一波长的荧光分子信标(发夹型杂交探针)荧光基团茎由互补配对的序列组成环与目标序列互补淬灭剂茎(5-7bp)环（15-30bp）FAMTexasRed分子信标工作原理探针杂交到DNA模板光发出荧光荧光基团DNA模板淬灭剂茎环光淬灭•分子信标能特异性地检测感兴趣的目标DNA•分子信标可用于单核苷酸多态性的检测•特别适用于检测点突变•只能用于一个特定的目标•设计困难•价格较高确定最佳阈值标准曲线法斜率的绝对值接近3.322R2接近1较好的区分样品重复平行样的Ct值之间的差0.5Thanks!