外周血单核细胞流式分析

外周血单核细胞流式分析(1)采集小鼠眼血，每只小300-500μl，新鲜外周血2500rpm离心20分钟，吸取上层血浆；(2)用PBS或生理盐水重悬下层血细胞，稀释倍数2-4倍，稀释倍数越高分离效果越好；(3)离心管内加入Ficoll，Ficoll上层缓慢的加入重悬细胞液，Ficoll与重悬细胞液比例1:2；(4)2000rpm离心20分钟，离心机设置为缓慢加速和缓慢减速；(5)离心后离心管内可见四层分液，从上向下依次为：PBS血浆混合液、PBMC、Ficoll、红细胞，Z字形吸取PBMC分层；(6)PBS或生理盐水清洗细胞三次并计数；(7)将细胞用PBS重悬，分组加入流式管中，每管100μl；(8)加入抗CD16/32封闭抗体，4℃反应10min，除去小鼠免疫细胞表面的非特异性染色；(9)根据抗体要求体积在流式管内加入抗体，常见的大比例细胞可只标记检测抗体，以下几种情况需要同时制备空白细胞管、同型对照管、检测抗体管检测：细胞比例含量低、细胞表面标志表达较弱、首次使用的新抗体、同时标记多类标志时需要每种标记都单独制备单一抗体标记管，4℃反应30min；(10)3ml1×PBS清洗一次，如需分选，用PBS重悬后直接上机；如需分析，用1%的甲醛PBS固定后检测，荧光染色最多保留48h。流式数据用FlowJo软件分析。