RACE技术

成员：RACE技术董碧秀古丽扎尔热依拉RACE简介RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3‘端和5’端的方法。RACE(rapid-amplificationofcDNAends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。RACE技术原理RACE是采用PCR技术由已知的部分cDNA顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法,又被称为锚定PCR(anchoredPCR)和单边PCR(one2sidePCR)。RACE技术主要分类一般分5'-和3'-RACE两种。3‘-RACE：3'-RACE较简单，首先将mRNA或总RNA用PolyT引物反转录，根据一般基因具有polyA尾巴的特点，选用特异引物(根据已知序列设计)和PolyT引物PCR即可。大多实验者反映一次PCR可以搞定。SMARTTM3‘-RACE的原理5'-RACE：5'-RACE相对较难，目前流行几种5'-RACE。其一为加接头(传统)，根据接头引物和自己设计特异引物PCR，可以设计巢式PCR二次扩增。另外，有利用反向PCR技术，连接成环在PCR。还有，GENE公司一种smartRACEPCR，利用反转酶末断加C特点,直接加上多G接头，转换模板而无需用连接酶加接头。利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMARTSMARTTM3‘-RACE的原理寡核苷酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。然后用一个基因特异引物GSP1(genespecificprimer,GSP)作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universalprimer,UPM)作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3‘末端的DNA片段扩增出来。SMARTTM3‘-RACE的原理图SMARTTM5'-RACE的原理先利用mRNA的3‘末端的poly（A）尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo（dT）30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA.利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5’末端时自动加上3-5个（dC）残基，退火后（dC）残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo（dG）通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头。SMARTTM5'-RACE的原理用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（universalprimer，UPM）作为上游引物，用一个基因特异引物2（GSP2genespecificprimer，GSP）作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5'末端的cDNA片段扩增出来。最终，从2个有相互重叠序列的3'/5'-RACE产物中获得全长cDNA，或者通过分析RACE产物的3'和5'端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA。SMARTTM5'-RACE的原理图RACE的另一种代表方法------------SELF-LIGATION法•1.反转录（RT）反应。•2.HybridRNA的分解。•3.单链cDNA的自身连接。•4.PCR扩增5'未知区域。•5.目的DNA片段的切胶回收。•6.DNA序列测定原理Figure三种5’RACE技术的比较与优化环化法5’RACESMART反转录酶法5’RACE末端脱氧核糖核酸转移酶(TDT酶)法5’RACE三种5’RACE技术的比较与优化目的研究环化法、末端脱氧核糖核酸转移酶法和SMART反转录酶法3种常用5'RACE的技术的特点，并对它们进行了优化。方法以播娘蒿RNA为模板，先按文献标准方法进行5'RACE，然后通过增加反应时间，提高部分反应物浓度等方法进行优化。结果未优化前环化法和TdT酶法条带几乎不三种5’RACE技术的比较与优化可见，SMART反转录酶法隐约可见条带，但不清晰。优化条件后，环化法出现弥散条带，TdT酶法胜之，但条带依旧弥散，而SMART反转录酶法最佳，获得清晰特异性条带。结论SMART5'RACE效果最好，其次为TdT酶法，环化法效果有待改进，同时通过优化条件可以明显增加产物的特异性，为实验研究中5'RACE方法的选择提供了依据。RACE的优点与筛库法相比较，有许多方面的优点：此方法是通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。节约了实验所花费的经费和时间。只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长实验室现有的RACE试剂盒的简介RACE是一种从一个相同的cDNA模板进行5‘和3‘末端快速克隆的方法。此方法会产生较少的错误条带。此过程中使用的酶混合物非常适合长链PCR。使用此方法的要求是必须知道至少23－28个核苷酸序列信息，以此来设计5’末端和3‘末端RACE反应的基因特异性引物（GSPs）。RACE引物的设计：基因特异性引物（GSPS）应该是23－28nt50－70％GCTm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。反应中涉及到的一些事项cDNA的合成起始于polyA+RNA。如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。RACEPCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。反应中涉及到的一些事项在进行5‘和3’RACEPCR的时候应该使用热启动。表4中给出了所有引物的相互关系。重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。另外，重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。反应中涉及到的一些事项引物GSP中的GC含量要在50－70％之间。这样可以使用降落PCR。避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。另外，避免使用与AP1互补的引物，尤其是在3‘末端。如果要用重叠片段来检测设计的引物，GSp1和GSp2之间至少是100－200碱基。只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。反应中涉及到的一些事项降落PCR可以明显的增加RACEPCR产物的特异性。在最开始的循环中，退火温度高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循环。验证基因特异性引物的对照单个引物的阴性对照：只用一个引物GSP来进行阴性对照。这样不应该产生任何的条带。如果可以看到明显的产物，应该改变循环的参数，或重新设计原始引物。验证基因特异性引物的对照利用两个GSPS进行阳性对照：（只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。）为了确定RNA样品中目的基因确实表达，利用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。如果没有这个片段，应该重复cDNA的合成，或者从一个不同的组织或细胞来源进行cDNA的合成。制备和抽提POLYA+RNA不要使用DEPC处理过的水。纯化完mRNA之后，利用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。哺乳动物的mRNA样品是0.5－12kb的拖带，在其中有4.5和1.9kb的rRNA的条带。非哺乳动物的mRNA应略小具体的实验步骤cDNA第一条链的合成：我们建议进行cDNA合成的对照反应，这样可以对样品的cDNA的合成进行鉴定。加入各种试剂之后，在水浴中42度保温一个小时。具体的实验步骤注意：在水浴或酒精浴中保温会减少反应体积，从而降低第一链的合成效率。将管放于冰上，以终止第一链的合成反应。直接进行第二链的合成。CDNA第二链的合成第二链合成的酶混合物中，含有聚合酶、RNaseH和连接酶。T4DNA聚合酶的功能是补平dscDNA的末端。我们建议做阳性对照，试剂盒中提供人类骨骼肌的mRNA。建议进行阳性对照,cDNA的质量取决于制备的polyA+RNA的质量。非哺乳动物样品的mRNA大约在0.5－3kb之间。通过电泳检测cDNA的产量，与对照进行对比，CDNA第二链的合成这样可以有利于在以后的步骤中对cDNA进行稀释。接头的连接及连接产物的稀释按照程序进行连接反应。如果没有对比样品和对照的产量，利用Tricine－EDTAbuffer制备接头连接的dscDNA的1/50和1/250的稀释物，用两种稀释物进行以下的RACEPCR反应，直到鉴定出哪一种稀释可以得到好的效果。RACE技术-PCR扩增RACE技术-PCR扩增我们建议使用降落PCR反应，这就要求GSP的Tm值≥70度。当循环结束时，利用1.2%琼脂糖凝胶电泳分析每一个管中的产物5μl，使用适当的分子量marker。RACE技术-PCR扩增可以根据你的基因的特异性来设计最理想的循环参数。如果看不到带或者只有微弱的带，在68度多加5个循环。最佳的延伸时间取决于扩增条带的长度。如果片断的长度在2－5kb的时候，经常使用4min，0.2-2kb的时候将延伸时间减到2－3min，对于5－10kb的条带，延伸时间增加到10min。RACE产物的验证应该对RACE的片段进行验证,以此来确定是否已经扩增了理想的产物。如果得到的是多条带或者研究的是多基因家族的成员，验证是非常有用的。有3种验证RACE产物的方法比较由GSP和NGSP获得RACE产物。Southernblot克隆并测序有3种验证RACE产物的方法我们建议最好测得RACE产物的部分序列。有的时候需要嵌套引物的存在。比较由GSP和NGSP获得RACE产物：对于5‘末端的RACE产物，比较由AP1和GSP1扩增出来的产物和由AP1和NGSP1扩增出来的产物。有3种验证RACE产物的方法对于3‘末端的RACE产物，比较由AP1和GSP2扩增出来的产物和由AP1和NGSP2扩增出来的产物。这对于鉴定多条带是否是上一个PCR的特异性产物是非常有用的。如果条带是正确的，在嵌套PCR反应中的条带应该是略微小一些。基本PCR和嵌套PCR产物的迁移率的不同取决于ｃＤＮＡ结构中GSP1和嵌套引物的位置。RACE技术-克隆和测序1.对于可以利用胶回收试剂盒来回收RACE产物，此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物；片段，可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法，最后用Tricine－EDTAbuffer30μl重新悬浮DNA样品。2.电泳5μl回收的样品来鉴定回收的质量。3.将回收的PCR产物直接克隆到/A型的PCR克隆载体中。另外还可以利用接头和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位点，将产物克隆到常规载体中。RACE技术-克隆和测序3.将回收的PCR产物直接克隆到/A型的PCR克隆载体中。另外还可以利用接头和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位点，将产物克隆到常规载体中。4.对于5‘端的RACE产物，我们建议挑取至少8－10个不同的克隆以获得5‘端的最大可能性的序列。（反转录并不总是进行到mRNA模板的5’末端，尤其是长模板。另外，T4DNA聚合酶会移走5‘末端的0－20个碱基。）RACE技术-克隆和测序5.一旦鉴定了含有插入片断的克隆，应该获得多的序列信息。理想的是，可以对整个开放读码框进行测序。包括5‘和3‘的非翻译区。RACE技术-CDNA的获得通过部分或全部测序鉴定了RACE产物后，可以通过两种选择获得全长的cDNA。通过PCR和克隆的方法。通过PCR的方法获得全长CDNA1.扩增长的cDNA需要较长的延伸时间，但是如果延伸的时间过长，可以产生拖带，所以要慎重的设计引物。2.根据从5‘和3‘RACE产物获得序列信息设计5’和3‘GSP引物。这些引物应该来自cDNA的3’或者5‘的末端，应该是23－28nt长。不应该在引物的末端加上限制性位点，