蛋白质组学在去泛素化酶研究中的应用

李衍常等/蛋白质组学在去泛素化酶研究中的应用ChineseJournalofBiotechnology(9):1341−1350DOI:10.13345/j.cjb.130658©2014ChinJBiotech,AllrightsreservedReceived:December23,2013;Accepted:February10,2014Supportedby:NationalBasicResearchProgramofChina(973Program)(Nos.2011CB910600,2013CB911200),NationalHighTechnologyResearchandDevelopmentProgramofChina(863Program)(Nos.SS2012AA020502,2011AA02A114),NationalNaturalScienceFoundationofChina(Nos.31070673,31170780),BeijingNaturalScienceFoundation(No.5112012),FoundationofStateKeyLabofProteomics(No.SKLP-Y201102).Correspondingauthor:PingXu.Tel:[phone]-1314;Fax:[phone];E-mail:[e-mail]国家重点基础发展研究计划(973计划)(Nos.2011CB910600，2013CB911200)，国家高技术发展计划(863计划)(Nos.SS2012AA020502,2011AA02A114)，国家自然科学基金(Nos.31070673,31170780)，北京市自然科学基金(No.5112012),蛋白质组学国家重点实验室基金(No.SKLP-Y201102)资助。1341生物工程学报蛋白质组学在去泛素化酶研究中的应用李衍常1，高媛1，徐忠伟1，兰秋艳1,2，徐平1,21军事医学科学院放射与辐射医学研究所蛋白质组学国家重点实验室国家蛋白质科学中心(北京)北京蛋白质组研究中心蛋白质药物国家工程研究中心，北京1022062武汉大学药学院组合生物合成与新药发现教育部重点实验室，湖北武汉430072李衍常,高媛,徐忠伟,等.蛋白质组学在去泛素化酶研究中的应用.生物工程学报,2014,30(9):1341−1350.LiYC,GaoY,XuZW,etal.Applicationofproteomicsindeubiquitinasesresearch.ChinJBiotech,2014,30(9):1341−1350.摘要:泛素-蛋白酶体系统是细胞内蛋白质特异性降解的主要途径，参与并调控细胞周期、免疫应答、信号传递和DNA修复等真核生物体内几乎所有的生命活动。去泛素酶的存在使泛素化修饰成为可逆过程，保证了泛素系统及其相关生理过程的动态平衡，其表达紊乱也是诱发多种疾病的主要原因。对去泛素化酶进行系统、全面的研究是理解其作用机制并将其作为治疗药物靶点的前提。蛋白质组学技术的快速发展为系统深入研究去泛素化酶提供了条件，特别是在去泛素化酶的相互作用网络和底物特异性研究等方面发挥了独特的作用。因此，文中结合课题组研究工作，对去泛素化酶的分类及功能进行介绍并总结蛋白质组学在去泛素化酶研究中的应用进展。关键词:泛素-蛋白酶体系统，去泛素化酶，蛋白质组学，蛋白质相互作用，质谱综述ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechSeptember25,2014Vol.30No.9(WuhanUniversity),MinistryofEducation,andWuhanUniversitySchoolofPharmaceuticalSciences,Wuhan430072,Hubei,ChinaAbstract:Asthemajorpathwaymediatingspecificproteindegradationineukaryotes,ubiquitin-proteasomesystem(UPS)isinvolvedinvariousphysiologicalandpathologicalprocessessuchascellcycleregulation,immuneresponse,signaltransductionandDNA-repair.Deubiquitinases(DUB)maintainthebalanceofUPSandrelatedphysiologicalprocessesviareversiblyremovingubiquitinfromthecovalentlymodifiedproteinsubstrates,whichhavebeenimplicatedinvariousdiseaseprocessesincaseoftheirimbalanceexpression.BecauseDUBplayscriticalregulatingrolesintheUPSpathway,theymaybealsotheidealdrugtargetsforsevereandintractablehumandiseases,suchascancerandneurodegenerativedisease.Withtherapiddevelopmentofproteomictechnology,systematicalinvestigationofspecificsubstratesandinteractingproteinsofvariedDUBviamassspectrometryapproachmayshedlightontheseDUB’sbiologicalfunctionandregulatingrolesinthephysiologicalandpathogenicstates.Inthisreview,webrieflyintroducethecharacteristicsofDUBandsummarizetherecentapplicationandprogressesofproteomicsinDUBresearch.Keywords:ubiquitin-proteasomesystem,deubiquitinase,proteomics,interactome,massspectrometry泛素(Ubiquitin,Ub)是一种含76个氨基酸，序列高度保守且广泛存在于真核生物中的小分子蛋白[1-3]。泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasomesystem,UPS)作为真核生物内特异、高效并依赖能量的蛋白质降解途径，参与了细胞周期调控、免疫应答、信号传递和DNA修复等众多重要的生命活动[4-7]。2004年，以色列科学家AaronCiechanover、AvramHershko和美国科学家IrwinRose因发现泛素介导的蛋白质降解途径而获得诺贝尔化学奖。泛素修饰是可逆过程，去泛素化酶(Deubiquitinase,DUB)的存在保证了UPS及其相关生理过程的动态平衡稳定[4,8-11]。目前已知酵母存在约20种DUB，人类存在约100种DUB。根据结构和催化机制，DUB可分为5大类，参与了泛素生成、修剪、回收和底物保护等多个过程[8]。DUB底物特异性主要表现为泛素链形式(Met1-linearfusion，K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)[12]的特异性和底物蛋白的特异性。如何系统研究众多DUB的特异性及其调控规律已经成为该领域的热点，也是难点。由于DUB是导致多种疾病的关键靶点，因此开发DUB特异性的抑制剂来调控其在代谢通路中的功能为药物开发提供了新思路。目前，以质谱技术(Massspectrometry，MS)为代表的蛋白质组学(Proteomics)在系统揭示生命过程和解释基因表达调控分子机制中发挥着重要作用[13-15]。随着高分辨率质谱的迅猛发展，蛋白质组学深度测序和精确定量技术在UPS研究中展现出独特的优势并呈现出良好的发展势头。2010年国际首届蛋白质组学与泛素相关会议PPDUP(Proteomicsofproteindegradation李衍常等/蛋白质组学在去泛素化酶研究中的应用[e-mail]1343andubiquitinpathways)在加拿大温哥华举行[16-17]。同样，蛋白质组学在DUB的相互作用网络研究和抑制剂的开发等方面也取得了众多成果。因此，本文将结合实验室的研究工作，对DUB进行简要介绍并总结蛋白质组学在DUB研究中的应用进展。1去泛素化酶介绍1.1去泛素化酶的分类根据催化机制，蛋白酶(Protease)包含天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和金属蛋白酶5大类[18]。DUB也属于蛋白酶，主要包括半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶2种。目前从酵母和人类中分离鉴定出了多种DUB，基于其结构相似性和可能的作用机制，主要分为泛素羧基末端水解酶(UbiquitinC-terminalhydrolase,UCH)、泛素特异性蛋白酶(Ubiquitin-specificprotease，USP)、卵巢肿瘤蛋白酶(Otubainprotease，OTU)、Machado-Josephdisease蛋白酶(MJD)和MPN(+)/JAMM蛋白酶(JAMM)5种类型，其中前4种属于半胱氨酸蛋白酶，JAMM为金属类蛋白酶。1.1.1泛素羧基末端水解酶UbiquitinC-terminalhydrolase,UCH)UCH是昀早被发现和表征的DUB。已知酵母中为YUH1，人类中的4个DUB分别是UCHL1、UCHL3、UCHL5和BAP1。UCH通过裂解C末端76位甘氨酸，将泛素分子从底物蛋白上释放出来。研究显示该类DUB底物偏好分子量较小的底物蛋白(20–30氨基酸)[9]。UCH活性位点上的狭窄裂隙和环状结构直径的限制在一定程度上起到了特异性识别小分子底物的功能[19]。UCH主要功能是将未成熟的串联泛素前体或者泛素-核糖体蛋白复合物进行修剪得到成熟的泛素。文献报道YUH1不仅在泛素生成过程中发挥作用，还特异性的对类泛素NEDD8/RUB1的生成起调控作用[20]。UCHL1特异性存在于神经元中，其活性与神经性疾病帕金森症(Parkinson’sdisease，PD)有关[21-23]。1.1.2泛素特异性蛋白酶(Ubiquitin-specificprotease，USP)USP家族是目前已知的去泛素化酶中成员昀多且结构昀具多样性的一类。已知酵母中为16个，人类约为60个USP。这些酶分子都含有两个短而保守的催化片段，即半胱氨酸盒和组氨酸盒，其中的催化三联残基(半胱氨酸、组氨酸、天冬氨