DNA的复制和修复解析

DNA的复制和修复遗传的中心法则1958年Crick提出以DNA为中心的遗传信息的传递规律，即DNA贮存的遗传信息通过复制传给子代DNA，通过转录传给RNA，再通过翻译传给蛋白质。遗传信息传递方向的这个规律被称为中心法则。DNARNA蛋白质复制复制转录翻译反转录？1970年Temin和Baltimore发现RNA病毒的RNA可通过反转录（逆转录）将遗传信息传给cDNA，也可通过RNA复制或RNA转录传给子代RNA，这是对中心法则的补充。1997年疯牛病和朊病毒的出现，预示蛋白质也可逆向将遗传信息向DNA传递。复制：以亲代DNA或RNA为模板，根据碱基配对的原则，在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。几个基本概念：逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的氨基酸顺序的过程。转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则合成RNA，即将DNA所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。Reversetranscription中心法则图示第一节DNA的复制复制：以亲代（母链）DNA为模板合成子代DNA的过程。复制亲代DNA子代DNA一、DNA的复制（一）DNA复制是半保留复制DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。•半保留复制的概念半保留复制的证明：Meselson和Stahl将同位素15N标记的15NH4Cl加入大肠杆菌的培养基中培养12代，使大肠杆菌的DNA都带上15N的标记，然后将该大肠杆菌转入14N的普通培养基中培养后，分离子一代、子二代、子三代、子四代DNA，进行氯化铯密度梯度离心，实验证明了DNA的半保留复制。15N-DNA的密度大于14N-DNA的密度AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA复制过程中形成的复制叉子代DNA按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。半保留复制的意义（二）DNA复制的起点和方式复制子：基因组能独立进行复制的单位叫复制子，每个复制子都含有控制复制起始的origin和终止复制的终点（terminus）。双向复制(bi-directionalreplication)、单向复制(unidirectionalreplication)；复制叉(replicationfork)或生长点(growingpoint)多复制子(multi-replicon)双向复制单向复制DNA复制的主要方式大肠杆菌双链环状DNA的复制（一个复制起点，双向复制）（细菌DNA复制叉移动速度50kb/min，大肠杆菌染色体完成复制需要40分钟，然而，大肠杆菌每20分钟即可分裂一次。如何解释？)真核细胞线状染色体DNA的复制方式（多个复制起点，双向复制）复制叉移动速度为1kb～3kb/min，高等真核生物一般复制单位长度为100～200kb，每个复制单位在30～60分钟完成复制，通常完成整个染色体复制的时间要用6～8h。一轮复制尚未完成，又启动新一轮的复制。3不同位置D-环式复制方式（线粒体双链环状DNA：两条链的复制起点不同位置，且复制不同步）单向滚环式复制（噬菌体X174DNA—单链环状）三、半不连续复制1、体内仅存在5’3’的DNA聚合酶2、前导链与随从链（岗崎片段）前导链滞后链冈崎片段前导链：DNA复制时，一股以3’5’方向的母链作为模板，新合成的链以5’3’方向连续合成的链称为前导链。滞后链：DNA复制时，一股以5’3’方向的母链作为模板，新合成链沿5’3’合成1000-2000个核苷酸不连续的小片段称为随从链。复制方向与解链方向一致复制方向与解链方向相反冈崎片段DNA半不连续复制：3’5’方向母链为模板，新链5’3’方向连续合成5’3’方向母链为模板，新链5’3’方向合成许多不连续的片段（岗崎片段）这种复制方式称之为半不连续复制。RNA引物DNA聚合酶•不能催化两个游离dNTP在DNA模板上聚合•需要具3’-OH的引物RNA聚合酶•能催化两个游离NTP在DNA模板上聚合•提供3’-OH•引物最后被DNA聚合酶Ⅰ除去、补满，再由连接酶连接减少突变，提高DNA复制的真实性四、与DNA复制有关的酶和蛋白质(一)DNA聚合酶：原料：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTPdCTPdTTP)需要模板：以DNA为模板链，合成子代DNA，模板可以是双链，也可以是单链DNA。合成产物与模板互补。需要引物：一小段RNA(或DNA）为引物，在大肠杆菌中，DNA的合成需要一段RNA链作为引物，引物含3’-OH.合成方向：533’5’5’3’外切酶聚合酶NC5’3’外切酶小片段大片段（klenow片段）切除RNA引物损伤修复校读功能（常用的工具酶）1、DNA聚合酶Ⅰ聚合功能DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ结构基因＊不同种类的亚基数目相对分子质量3’→5’外切酶5’→3’外切酶聚合速度（核苷酸/分）持续合成能力功能PolA1103,000＋＋1,000-1,2003-200切除引物，修复PolB≥788,000＋－2,4001,500修复PolC≥10830,000＋－15,000-60,000≥500,000复制大肠杆菌三种DNA聚合酶比较(三）DNA连接酶：连接DNA双链中的单链切口作用特点：T4噬菌体的DNA连接酶不仅能连接双链DNA上的粘性切口，而且能连接无粘性末端的平头双链DNA。DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用。POO-O-OHO5’POO-O-O3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’(四)与DNA合成有关的其它蛋白因子(大肠杆菌中)蛋白质功能相对分子量（×103）分子/细胞DNA旋转酶（或拓扑异构酶）DNA解链酶单链结合蛋白引物合成酶DNA聚合酶Ⅰ引入或松开超螺旋使双链DNA解链稳定单链区合成RNA引物除去引物并填满缺口400657460109503001003001、拓扑异构酶拓扑异构酶：催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶，在DNA重组修复和其它转变方面起重要作用。除连环数不同外其它性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体，引起拓扑异构体反应的酶称为拓扑异构酶。2、解螺旋酶（解链酶）通过水解ATP将DNA两条链打开。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。稳定DNA解开的单链，防止复性和保护单链部分不被核酸酶水解。3、单链结合蛋白：引发体可以沿模板链5’3’方向移动,具有识别合成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引发RNA引物的合成。移动和引发均需要ATP提供能量，n’蛋白具有ATP酶的活力。引发体的移动与复制叉移动的方向相同，与冈崎片段的合成方向相反。4、引物合成酶与引发前体引物合成酶：催化引物RNA的生成引发前体:它由多种蛋白质dnaA、dnaB、dnaC、n、n’、n’’和i组成。引发前体再与引发酶结合组装成引发体。（五）、参与DNA复制的酶与蛋白因子总览图五、DNA的复制过程：（以大肠杆菌为例）复制的终止：复制的起始1、起始复合物的形成：称为引发2、RNA引物的合成链的延伸：复制原点oriC和原点的识别：DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。常用oriC(或o）表示。大肠杆菌的复制原点oriC由245个bp构成，含两组保守的重复序列：三个13bp的序列（富含A、T的序列）和四个9bp的序列；许多生物的复制原点也都是富含A、T的区段。（一）复制起始1、拓扑异构酶解开超螺旋。2、DnaA蛋白识别并在ATP存在下结合于四个9bp的重复序列。3、在类组蛋白HU、ATP参与下，DanA蛋白变性13个bp的重复序列,形成开链复合物。4、DnaB借助于水解ATP产生的能量在DnaC的帮助下沿5’→3’方向移动，解开DNA双链，形成前引发复合物。5、单链结合蛋白结合于单链。6、引物合成酶（DnaG蛋白）开始合成RNA引物。(二)链的延长（冈崎片段的合成）真核生物的冈崎片段为：100-200bp原核生物的冈崎片段为：1000-2000bpDNA链的延伸在DNA聚合酶Ш的催化下，以四种5’-脱氧核苷三磷酸为底物，在RNA引物的3’端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。DNA链的延伸同时进行前导链和滞后链的合成。两条链方向相反。前导链滞后链冈崎片段半不连续复制冈崎模型冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接:(三)复制的终止顺时针终止陷阱逆时针终止陷阱Ter:终止陷阱，引起复制终止的特定区域，20bp的序列，终止利用物质Tus可识别并结合，从而导致DNA复制的终止。(四)DNA复制的精确性（高保真复制）1、碱基的配对规律：摸板链与新生链之间的碱基配对保证碱基配错几率约为1/104～1/105。2、DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性的校对功能，使碱基的错配几率又降低100～1000倍。3、DNA的损伤修复系统。DNA复制必须具有高度精确性，在大肠杆菌的细胞DNA复制中其错误率约为1/109～1/1010，即每109～1010个核苷酸才出现一个错误，也就是大肠杆菌染色体DNA复制1000～10000次才出现一个核苷酸的错误。这么高的精确性的保证主要与下列因素有关：四、DNA的损伤与修复DNA修复的基础：一条链有损伤修复酶切除以未损伤的链为模板合成原来相同的序列（一）造成损伤的原因•自发因素•物理因素•化学因素•紫外线损伤（共轭双键）•电离辐射损伤（X线/线）•亚硝酸盐CU•5-溴尿嘧啶5-BUA•氮芥类烷化剂•羟胺C-AGG羟胺（二）修复机制光修复（低等生物）•不需光复活酶•需光复活酶（photoreactivationrepair）•嘧啶单体嘧啶二聚体•嘧啶单体嘧啶二聚体光复活酶（+）蓝光280nm239nm1、直接修复光复活/光修复①光复活酶识别TT→与之形成复合物②吸收光能③使TT解开成为单体④酶从复合物中释放仅作用于UV形成的产物O6甲基鸟嘌呤直接被修复2、切除修复（excisionrepair）（1）UV特异核酸内切酶切除DNA聚合酶Ⅰ填补、修复DNA连接酶连接（2）人体重要的修复方式，对多种损伤均能起修复作用。（3）缺乏UV特异核酸内切酶——着色性干皮病切除修复发生在复制之前核苷酸切除修复•dUTP酶可以分解dUTP为dUDP和dUMP胞嘧啶C自发脱氨氧化生成尿嘧啶U——尿嘧啶-N-糖苷酶•腺嘌呤脱氨成次黄嘌呤——次黄嘌呤-N-糖苷酶•烷基化修饰的碱基被糖苷酶除去AP位点（apurinic/apyrimidinicsite）无嘌呤或无嘧啶位点碱基切除修复DNA糖苷酶识别切除改变的碱基核酸内切酶切除磷酸二酯键DNA聚合酶Ⅰ填补DNA连接酶连接DNA糖苷酶具特异性识别-----DNA中的异常碱基水解-----异常碱基与脱氧核糖间糖苷键使其脱落DNA碱基的组成为何是“T”？（1）DNA中的C容易突变成U（2）尿嘧啶DNA糖苷酶识别DNA中的U（3）若DNA中存在U，无法区别突变U和正常U•DNA中T的存在增加遗传信息的稳定性•RNA中的U：数量多/半衰期短/经济碱基切除修复DNA损伤核苷酸切除修复3、错配修复——耗能的过程CH3GATCCTAGGTGATC5´3´CTAG3´5´GTCH3CH3GATCCTAGGTMutHMutSMutL切口CH3GATCCTAGGT5´3´CH3GATC5´3´CTAG3´5´TG