搜索
DNA复制(DNAReplication)2.1.基本概念2.2.复制起点与方向2.3.Semi-ConservationReplication2.4.复制的方式2.5.线状DNA的复制2.6.DNA复制的基因与酶类体系2.7.DNA复制速率及拷贝数的调控2.1基本概念(BasicConcept)遗传物质的分子机制分子生物学的核心Watson&Crick:一种遗传物质，必须能行使两种功能，即自我复制和对细胞的高度特异性的影响遗传物质的基本属性：基因的自我复制控制性状的表达DNA复制亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以每单链DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP,合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。●Replicon;●Replisome;AunitofthegenomeinwhichDNAcontainaregionfromorigintoterminatorThemultiprotein(30±)structurethatassemblesatreplicatingforktoundertakesynthesisofDNADNAreplicationatphaseSofcellcycleE.coli37℃0.5h105bp/minS6-8hsM1hG23-4hsmammaliancell22-25hrs500-5000bp/minG112hs•复制机理的复杂性D.S.DNAS.S.DNA能量的供求构型的变化超螺旋线状，开环状多种酶类的互作ReplisomeDNA复制起始控制机理知之甚少复制的准确性（修复，校正）研究试材的特殊性（温度敏感型ts，突变抑制体系Su）DNA复制速度(E.coli105bp/min，高速解旋112km/h?)缺乏统一的模式(D.S.DNA,S.S.DNA,LinearDNA….)2.2.复制起点与方向（replicationorigin&direction）isolationofori概念：DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。常用ori(或o）表示。许多生物的复制原点都是富含A、T的区段。复制叉的形成GATCTNTTNTTTTTTATNCANA3×13bp直接重复序列DnaA结合位点，4×9bp大肠杆菌DNA复制起始点（oriC）保守序列分布图K=G/T,S=C/G,andY=C/T.复制叉的形成互相缠绕的双链母本DNA，复制从特定的位置(复制原点OriorO)开始，该位置常是富含A、T区段。复制叉的形成DnaA蛋白可识别复制起点并与之结合，这是随后起始事件的基础。一旦结合复制起点DNA，DnaA蛋白会获得额外的性质：1、可促进DNA扭曲，使螺旋酶能进入；2、可帮助其它与复制叉组装有关因子进入。复制叉的形成DnaA蛋白作用于oriC左侧的的3个13bp的串联重复序列，使这3个13bp解链，这个过程需能（ATP）；•然后是DnaB的进入，DnaB实际上是使DNA解链的螺旋酶，取代13bp处的DnaA蛋白，并与DNA旋转酶协同作用，促使大范围的解链；•SSB蛋白结合到单链DNA上，稳定单链DNA。•复制的多模式单起点、单方向多起点、单方向单起点、双方向多起点、双方向DirectionofDNAreplication单向复制双向复制•子链DNA延伸方向DNApolymerasereactsonthe3’endonly5’OHTCATCAC5’OH3’NewDNAelongationfrom5’to3’directionpppOHC++ppi进化中保留的深刻的、选择与适应的、化学及功能的根源如果DNA的延伸方向是3’→5’ATCG+5’pppOH3’GpppOHGATCG5’pppOH3’ATCG+5’pppGpppG5’ppp因能量的需要，DNA的5’端必须带有PPP游离dNTP具有ppppppOH3’ATCG在0.2MNaCl的生理环境中，磷酸基团间的强电负性，使dNTP难以聚合到DNA的5‘端，而且双链DNA的5’端碱基配对困难需要其他机制以解脱OHOH3’碱基发生错配后的校正……费时、费能、增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗ppp+pppApOHTCGpppOHTCGTCGpppOHOHATCG2.3.DNA的半保留复制（Semi-ConservationReplication）(CsClgradientcentrifuge)N15N14DNASemi-ConservationReplicationM.MeselsonandF.W.Stahl,Sciences44:675,1958.Threereplicationhypotheses3‘5‘OK!How?5‘3‘5‘3‘b)半不连续复制c)（semi-discontinuousreplication）证据•dumpfragmentinDNA2.4.DNA复制的方式(DNAreplicationmodel)●新起始方式（denovoinitiation）或复制叉式（replicationfork）startingpoint(Cairrnsmodel,θform)→RNAprimer→transcriptionactivation→leadingstrand→fork→laggingstrandmultiplerepliconEukaryote(500-5000bp/min)•primer(DNA聚合酶不能发动子链DNA的复制起始)E.coli[Rifs][RifS]+M13E.coliE.coli[RifR]M13+S.S.DNAvirus+RF无M13RFRifampinM13Rifampin有M13RF有M13RFM13Rifampin•Rifampin是E.coliRNApolymerase的抑制剂•M13RF的形成需要RNApolymerase发动合成一段RNA分子作为引物•RF启动后，Rifampin的抑制无效Conclusion•DNA复制的转录激活(transcriptionalactivation）RNApolymerase[RifS]10NtRNAprimerforleadingStrandorigindnaGprimase[RifR]forlaggingStrandDNA新起始方式（denovoinitiation）复制的基本模式ParentalD.S,DNAUnwindingproteinRNApolymerasePrimaseDNApolymeraseleadingStrandlaggingStrandElongationoflag.&lea.strandsDNApolymerasePoly(dNt)ligaseReplicationloopRNAprimerRNA-primedDNApieces(1kb)Continuous5’to3’inLeadingS.Discontinuous3’to5’inlaggingS.TwolongDNApiecesManyshorterDNApieces(1-2kb)Repair&fillingin5’to3’BidirectionallengtheningofnewstandsprimosomeSynthesisofprogenystrandinlaggingDNApppRNAasprimerDNApolymeraseIIIpppDNApolymeraseIDNAligase•RNApol(RNApolymerase)[RifS]•dnaG(primase)[RifR]完成对后随链引物的合成•完成10±NtRNA引物合成后.DNApoIII进行DNA链的延伸•DNApolI（RNaseH）对后随链的RNA引物切除并聚合填补•连接酶(ligase）将Okazaki片段连接完成对先导链引物的合成实现DNA复制的转录激活起始较先导链的启动落后一个Okazaki片断Conclusion●共价延伸方式（covalenceelongation）或滚环方式（rollingcircle）D.S.DNA→Nick→leadingStrand→Elongation→rolling→LaggingStrand(δform)InmitochondrialDNAalsoinchloroplastDNA●置换式(D-loop)（Displacementform）D.S.DNA→S.S.DNAastemplate→NewS.S.DNA→Displacement→D-Loop复制叉两侧DNA双螺旋的解旋E.coliC/genome=3.2×106bp,40分钟/每次复制历时,10bp/每圈螺旋84000bp解旋/分(8400rpm!高速离心机)DNAtopoisomeraseIDNA的单链瞬间断裂（transientsingle-strandbreak）缓解高速旋转DNAtopoisomeraseIIDNA的双链瞬间断裂（transientdouble-strandbreak）缓解高速解旋时，DNA双链的相互缠绕zTopI,TopIIHelicase(repprotein)SingleStrandBindingprotein(SSB)Helixdestabilizingprotein(HDP)DnaBproteinDnaCproteinPrimaseUng-aseDNAPolymeraseIIIDNAPolymeraseILigaseforprimosome复制体进化中形成了灵活的多酶复合体replisomePrimosome（consistsofsixproteins）PriA(dualrole)displaceSSBfromS.SDNAandhelicaseDnaTrequiredatpreprimingstageDnaBiscentralcomponent,actionwithDnaCDnaCiscentralcomponent,actionwithDnaBPriBfunctionisunknownPriCfunctionisunknownDnaGprimase进化中形成了灵活的多酶复合体replisome位于复制叉处的多酶复合体完成laggingStrandDNA延伸时•必须快速从一个冈崎片段移到另一冈崎片段•InlaggingStrand多酶系统必须完成多次反复的启动与延伸E.coli启动2000—4000次的冈崎片段复制2.5.线状DNA的复制及避免5’末端短缩的模式3’-OH?3‘-OHLaggingstrandofcircleDNAreplicationLaggingstrandoflinearDNAreplicationBut3‘5‘5‘3‘3’-OH?a)WatsonJ.Db)T7phage•DirectrepeatintheendoflinearDNA•ConcatermerbetweentwooffspringDNAafterreplication(100dNtterminalredundancy)??concatermer3‘-OHATCGTAGCATCGTAGC3‘-OH机制二：进入宿主前就环化机制三：末端冗余还有其他方式。真核生物染色体DNA末端补齐模式●端粒的发现•1938MullerX-rayDrosophila末端极少发生缺失和倒位推测染色体两端存在特殊结构，使染色体趋于稳定.并定名为Telomere•1938B.McClintock顶端缺失染色体易于融合，而正常染色体不易连接。推测染色体末端具有特殊端粒结构。1970s分子生物学发展端粒研究获得突破●端粒DNA(Telomer)TTGGGG(T2G4)序列高度重复的末端5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3’(richGchain)3’AACCCCAACCCCAACCCC5’(richCchain)●1985.CarolGreider&Blackburn,1986.Gottchling尖毛虫telomerebindingprotein–