chapter7-DNA-replication

WelcometomolecularbiologyclassTeacher:zhangjie交流QQ:173031832DepartmentLifescienceDNAreplication分子生物学系列讲座之4LOGOYOURSITEHEREDNAReplication•人类面临的一个重要问题就是生命如何延续的。其中最重要的一个机制无疑是靠DNA复制产生子代细胞。了解DNA的复制必须解决以下的问题：“在细胞分裂是另外的DNA来自哪里？DNA是如何复制的？”Themaincontent3.1Relationterms3.2thedirectionandmannerofDNAcopy3.3StepsofDNAReplication3.4TopologicalchangeofDNAReplication3.5DNAdamageandrepairgenemutation3.1TermsRepliconOriginTerminusReplicationforkProkaryotesEukaryotesMultirepliconAutonomouslyreplicatingsequence(ARS)RollingcircleReplicativeform(RF)ORiCorigin、direction、terminus?researchmethod：1.Isotopemarker、electronmicroscopeview、degenerationmethods2.Bacteriophageinsertingcultivatemethods：synchronouscultivate、desynchronycultivate3.denaturationmapping4.BidirectionalelectrophoresisMeselson-Stahleexperiment米西尔逊-斯塔尔的实验Taylorexperiment泰勒的实验Cairnsreplicationmodel卡尔文斯的实验1、Meselson-StahlexperimentonE.coli(prokaryote)------1958米西尔逊-斯塔尔的大肠杆菌实验(原核生物)2020/4/4测序泰勒的真核生物实验Broadbean（蚕豆）根尖3H（氚）Chromosome(染色体)2、HerbertTayloroneukaryotewith3H-----19583、Cairnsreplicationmodel----1963卡尔文斯的Ɵ复制模型Ecoli（大肠杆菌）3H-T(氚-胸腺嘧啶)思考题：怎样证明DNA的复制的方向?复制的起点和终点在哪里?图4-6Cairns证明E.coliDNA双向复制的实验TheReplicationOriginofDNAdenaturationmappingoriCoriCoriCIsotopemarker&electronmicroscopeview相对基因频率（放射活性）ilvtactrphistyrmalAthrilvDNA复制起点的测定（分子杂交法）thr0/100lacattλ25trptre终点his50tyrcycCmalA75起点oriCilv复制起点和终点的位置DeterminationofDNAReplicationoricmolecularhybridization(method)Origination&terminitationofreplication图4-7Okazaki的脉冲标记和脉冲追踪的实验图4-8Okazaki的脉冲标记和脉冲追踪的实验结果分析图4-9Okazaki的脉冲标记和脉冲追踪的实验结果图4-10DNA的半不连续复制大肠杆菌DNA的复制DNAReplicationofE.coli•大肠杆菌基因组4.6×106bp•DNAPolⅢ合成速度约900nt/s•DNAreplicationtime:42min(4.6×106/900/60/2=42min)•实验结果表明：基因组合成需40min，分裂过程需20min，因此繁殖一代需60min•两条DNA链上GATC序列中模板链A6甲基化图4-38甲基化对原核细胞DNA复制的调节甲基供体s-腺苷甲硫氨酸终点起点起点终点起点起点终点起点起点终点起点起点10min5min15minWelcometomolecularbiologyclass欢迎走进分子生物学课堂Teacher:zhangjie教师:张杰DepartmentLifescience生命科学系DNA--mRNA--protein教学目标•理解DNA分子复制的概念和必需条件•理解DNA分子准确复制的原因•理解DNA分子复制的过程,特点和意义substrate(底物)dATP、dGTP、dCTP、dTTP(dNTP)Topoisomerase(Ⅰ,Ⅱ)DNAhlicase→ATPDnaB，PriA，Rep5’3’3’5’图4-19DNA拓扑异构酶的催化的转酯反应图4-20I型DNA拓扑异构酶的作用机理图4-21II型DNA拓扑异构酶的作用机制表11-3E.coli及噬菌体的解旋酶解旋酶结构功能DnaB330K六聚体结合与OriC,Oriλ参与前引发分离双链，水解ATP,提供能量。rep蛋白66K单体ATP依赖性解旋酶，在φX174滚环复制中推进复制叉PriA(w蛋白)82K单体φX174Rf形成中参与前引发体3’→5′移动取代SSB，识别特异位点。TraY/I多聚体F因子滚环复制中解链。基因4蛋白58KT7噬菌体复制中延5’→3′解链。图4-17DNA解链酶的作用模型图4-18E.coli-SSB与单链DNA结合的协同效应Single-strandedbindingprotein(SSB)图4-3证明DNA复制的方向始终是5′→3′的末端终止实验1957，ArthurKornberg,E.coli•快停突变（fast-stopmutants）：把细菌培养温度提高以后（42℃－45℃）复制迅速停止（图11-8），说明这种突变所涉及的产物和链的延伸有关。•慢停突变（slow-stopmutants）：指将细菌培养温度提高以后，DNA合成并不立即停下来，待延续一段时间后合成才会停止。慢停突变表明突变的基因和复制起始有关。图4-12Klenow酶的晶体结构模型ThumbFingersPalmSchematicofDNApolboundtoaprimer:templatejunction图4-13DNApol的聚合和校对DNApolymeraseⅠ(DNApolⅠ)1.聚合作用5'→3'2.外切酶活性3'→5'3.外切酶活性5'→3'4.模板结合位点5.引物结合位点6.引物3'-OH结合位点5´3´ppppOH3´ACTG1´5´3´ppppOH3´ACTG1´5´3´ppppOH3´ACTG1´DNA聚合酶的校对功能聚合酶错配硷基复制方向正确核苷酸5´5´5´3´3´3´切除错配核苷酸•DNA聚合酶I的dNTP掺入效率600dNTP/min•理论需要100h的复制过程(实际需要40min)•不具有很强的推进力（processivity）•DNA聚合酶I主要负责缺口平移（nick-translation）•DNA复制酶III•具有较强的推进力（50万个dNTP）•每秒钟掺入1000个dNTP•出错率10-7dNTP，加上校对（proofreading）活性，最终出错率为10-10，相当于每1000个大肠杆菌只含有一个碱基错误！DNApolymeraseⅢ1.聚合作用5'→3'2.外切酶活性3'→5'DNApolymeraseⅡ1.聚合作用5'→3'2.外切酶活性3'→5'DNApolymeraseⅣ（DinB）&Ⅴ（UmuC）错误倾向修复5´3´subunitnumbergenefunctionα2polCPolymerizationactivityε2dnaQ3’-5’exonucleaseθ2holEorganizationnucleaseτ2dnaXTomakethecoreenzymedimerizationγ2dnaXATPenzymedependonDNAδ1holACombineβsubunittoformγcompoundδ′1holBformγcompoundψ1holCformγcompoundβ1holDformγcompoundχ1dnaNFormclampxτβstructureandfounctionofEcoliDNApol-ⅢProlongingfactorDNApol-ⅢheterodimersCoreenzyme校对Binding&recognizingprimerTomakethecoreenzymedimerizationδ’DNApol-ⅢtwosubunitnipDNA图4-15β滑动钳的三维结构图4-16真核细胞DNApolδ由PCNA三个亚基构成的滑动钳结构（被包被的是DNA模板）3’5’3’5’5’3’5’3’5´3´如果DNA延伸到方向是3’→5’图4-22E.coli引发酶的结构模型DNA复制的引物酶（primase）和RNA聚合酶（RNApolymerase）3535引物酶催化合成短链RNA引物分子引物5´3´ppppOH3´ACTG1´图4-23DNA连接酶的三步核苷酸转移反应图4-24依赖于ATP的DNA连接酶的作用机理DNAligasemodifygapMg2+ligaseATPorNAD＋AMP+PPiorNMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGPnick3'3'5'5'5'5'3'3'templatetemplate图4-14DNApolI催化的缺口平移真核生物的DNA聚合酶（详见p145）原核生物DNA复制的过程：起始1.细菌复制起点含有3个13-mers和4个9-mers同源结构域2.酵母菌的复制起点称自主复制序列(ARS).其中“A”区域是必须的,而B1,B2和B3可以增强复制效率.图4-28E.coli的OriC结构图4-29E.coliDNA复制过程中引发体的形成图4-30E.coliDNA复制过程中复制体的形成图4-31E.coliDNA复制的延伸原核生物DNA复制的过程：延伸DNA延伸经过复杂模版区1.出现复制错误2.引起DNA聚合酶“停顿”（stalling，pausing）或与模板链解离3.该区段DNA序列不能合成合成策略：1.DNA跨缺刻合成（back-uppathway）2.重组依赖的DNA复制3.DNA合成重新开始3’5’β夹子ɤ复合体CoreXPolIII3’RecA+ATPRecA*RecA*RecA*SSBpolVAX图5-20DNApolV参与的跨损伤合成的详细步骤DNA合成的终止•线性ＤＮＡ终止策略1.ＤＮＡ末端变成发夹结构2.利用ＤＮＡ末端蛋白所含的氨基酸侧链ＯＨ3.线性ＤＮＡ转化成环状ＤＮＡ4.利用端粒酶策略5.利用同源重组辅助策略进行末端合成DNA合成的终止1.利用和DNA末端结合的蛋白质中的OH引导DNA的合成：如病毒2.把线性DNA转化成环形DNA分子：如微生物3.大肠杆菌基因组DNA合成终止：Ter位点（DNAsynthesisterminationregion）图4-32E.coliDNA复制终止区的结构图4-33子代DNA的分离复制的起始识起点,解超旋.解双链,复制叉.复制体,成回环.复制的延伸3′→5′模板链,5′→3′长子链.5′→3′模板链,5′→3′断子链.复制的终止切引物,补缺口.连片段,成子链.解旋酶DNA聚合酶III解链酶RNA引物引物酶和引发体DNA聚合酶ISSB3´3´5´3´5´5´RNA引物Thecharacteristics