生物化学19DNAreplication

INFORMATIONTRANSFER?DNARNA蛋白质转录翻译复制逆转录RNA复制Chapter19DNAReplication,RepairandRecombination复制的要点–1半保留复制–2有起始点、终止点和方向–3半不连续复制§19.1半保留复制半保留复制(semiconservativereplication)----当细胞分裂,DNA进行复制时，双螺旋结构解开而成为单链，用于合成新的互补链。子代细胞出现新的DNA双链，其中一股单链是从亲代完整地接受过来的。另一股单链完全重新合成，且按碱基配对原则互补。DNA半保留复制的证据第一代第二代细菌（含15N-DNA)普通DNA普通DNA重DNA重DNA普通培养基普通培养基细菌DNA双链密度梯度离心15N-DNA14N-DNA§19.2DNA复制的酶学1.底物dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)2.聚合酶DNA聚合酶（DNA依赖的DNA聚合酶)DNA--pol3.模板单链的DNA母链4.引物寡核苷酸引物（RNA)5.其他酶和蛋白质因子解链酶，解旋酶，单链结合蛋白，连接酶DNA聚合酶的活性5′至3′的聚合活性–5′→3′方向核酸外切酶活性–5′→3′外切酶活性–3′→5′外切酶活性一、复制的化学反应5′至3′的聚合活性（5′→3′）pppppppPPPOH＋OHOH55γβα＋PPiN1N2N3N1N2N3′5′33′′′核酸外切酶活性3′→5′外切酶活性5′→3′外切酶活性5335′′′′3′→5′外切酶活性5′→3′外切酶活性二、DAN聚合酶（DNApolymerase)(一)原核生物：–polⅠ与校读，修复有关小片段5′→3′核酸外切酶活性大片段（Klenow片段）聚合活性、3′→5′外切活性常用的工具酶–polⅡ：不含5′→3′核酸外切酶活性–polⅢ真正起复制作用的酶由10种亚基组成的不对称二聚体，α、ε、θ组成核心酶聚合活性、3′→5′外切活性（二）真核生物（DNA-pol）：α与随从链的合成有关β核酸外切酶活性与修复有关γ存在于线粒体δ与领头链的合成有关ε与校读、修复和填补缺口有关（三）DNA聚合酶的核酸外切酶活性和复制的保真性–核酸外切酶活性和即时校读DNA-polⅠ，Ⅱ的3′→5′外切酶活性–复制的保真性和碱基选择polⅢ的ε亚基先形成氢键，再生成磷酸二酯键–依赖四种机理1遵守严格的碱基互补配对规律2聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能3复制中出错时有即时校读功能4使用核苷酸代谢调节库三、复制中解链和DNA分子的拓扑学变化（一）解螺旋酶–先导链rep蛋白DnaB–滞后链解链酶Ⅱ35rep蛋白解链酶Ⅱ5′35′′′3′′SSB领头链随从链（二）DNA拓扑异构酶(解旋酶）既能水解，又能连接磷酸二酯键拓扑酶Ⅰ切断DNA双链中的一股拓扑酶Ⅱ切断DNA双链（三）单链DNA结合蛋白（SSB）–维持模板处于单链状态–保护单链的完整四、引物酶和引发体引物酶RNA聚合酶DnaG（RNA聚合酶）引发体DnaA辨认复制启始点，再结合DnaB,DnaC及其他复制因子形成复合体五、DNA连接酶（ligase）催化两段DNA之间的连接35535353HOPDNAligaseNADATPNMNAMP+PPi′′′′′′′′+POHP5533+53′′′′′′DNAligaseOOHPOOO-OOHPOOOPP--αβγPPi§19.3DNA生物合成过程一复制的起始（一）DNA解成单链原核生物：单向复制；双向复制：从一个固定的起始点开始，同时向两个方向进行的，称为双向复制θ复制起点起点起点原核生物DNA的双向复制真核细胞染色体比较复杂，可能有多个复制起点，同时形成多个复制单位复制叉----复制开始后由于DNA双链解开，在两股单链上进行复制，形成在显微镜下可看到的叉状结构，称为复制叉E.coli复制起始点oriC跨度为245bp，包含有三组串联重复序列和两对反向重复序列（二）引发体的生成复制过程需要引物--短链RNA–引物酶合成RNA引物（十个bp左右），方向为5′到3′引物酶进入，加上解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶（DnaG蛋白）和DNA的起始复制区域形成引发体。DNA聚合酶Ⅲ由其β亚单位辨认引物，新链的第一个脱氧核苷酸与引物的3-OH形成磷酸二酯键，开始复制拓扑异构酶松弛螺旋。复制过程中各酶和蛋白质因子的作用拓扑异构酶解链酶单链结合蛋白DNA聚合酶引物酶及引发体DNA连接酶引物领头链随从链冈崎片段5′5′3′3′二复制的延长–原核生物为polⅢ–真核生物为DNA聚合酶α和δ，其中α与随从链的合成有关，δ与领头链的合成有关（一）复制延长的生化过程–原核生物复制延长的速度很快，–真核生物复制有多个复制起点，（二）复制的半不连续性和冈崎片段前导链是连续合成的，而滞后链则是不连续合成冈崎片段冈崎用电子显微镜看到了DNA复制过程中出现一些不连续片段，这些不连续片段只存在与DNA复制叉上其中的一股。后来就把这些不连续的片段称为冈崎片段。（三）滚环复制——低等生物如质粒，复制时采用滚环复制。——环状DNA双链一股先开一个缺口，5′端向外伸展，——两股链均直接作为模板，不需要另外合成引物。35′′535′′′领头链随从链53′′53′′滚环复制三复制的终止（一）原核生物复制终止及不连续片段连接——复制有终止点——前导链是不间断延长的，滞后链是生成一个个的冈崎片段，最后连接成一条完整的DNA链。polⅠ5′→3′外切酶活性水解引物polⅠ聚合活性填补空隙DNA连接酶连接缺口。3355′′′′3355′′′′3355′′′′polⅠDNA连接酶3355′′′′5′3′3′5′polⅠ(二)真核生物的端粒和端粒酶端粒(telomere)是真核生物染色体线性DNA分子末端的结构–富含GC的重复序列–Vertebrate：(TTAGGG)n端粒酶(telomerase)RNA--蛋白质复合物既有模板，又有逆转录酶–以自身的RNA为模板延长DNA单链，然后反折为双链,爬行模式–端粒酶与生物体的衰老、肿瘤的发生有关§19.4逆转录现象和逆转录酶RNA病毒逆转录酶(reversetranscriptase,RT)–逆转录活性–RNaseH活性–DNA聚合酶活性RNA模板杂化双链单链DNA双链DNA反转录酶RNaseH碱水解DNA聚合酶整合S1核酸酶细胞内复制试管内合成反转录酶反转录酶§19.5DNA的损伤修复突变-----DNA分子上碱基的改变——自发突变、人工诱变一突变的意义——突变是进化、分化的分子基础——只有基因型改变的突变——致死性的突变——突变是某些疾病的发病基础二、引发突变的因素诱变因素突变类型物理因素紫外线照射形成胸腺嘧啶二聚体离子辐射打断DNA分子上的共价键化学因素5-溴尿嘧啶(5-BU)5-BU取代A，并异构成G，结果是A-T配对变为G-T配对，最后变为C-G配对羟胺转换T为C，结果是A-T配对改为C-G配对亚硝酸盐使C脱氨成U，原G-C配对变为G-U配对，最后使G-C变为A-T氮芥类使G的N-7烷化后除去，成为无鸟嘌呤的链生物因素肿瘤病毒插入宿主细胞基因组中，引起细胞癌变诱变因素及突变类型三、突变分子改变的类型错配（点突变）–一个碱基改变缺失、插入和框移突变–片段插入或缺失重排–较大片段重组或重排c-rasH基因P21ras产物GGCCAGglyglnGTCval※EJ/T24细胞株的突变四、损伤的修复损伤--复制过程中发生的DNA突变光修复切除修复重组修复SOS修复（一）光修复紫外光照射可使相邻的两个T形成二聚体光修复酶可使二聚体解聚为单体状态，DNA完全恢复正常。光修复酶的激活需300-600μm波长的光。NNCH3OORHPHROOCH3NNNNCH3OORHHNNCH3OORPUVTT光修复酶（二）切除修复参与的酶有核酸内切酶，polⅠ,DNA连接酶特异核酸内切酶polⅠDNA连接酶（三）重组修复重组蛋白RecA，polⅠ，连接酶参与损伤会保留下去（四）SOS修复DNA损伤面太大，复制难以继续。复制，修复的酶，重组蛋白RecA，调控蛋白LexA等组成一个庞大的调控网络。特异性很低着色性干皮病患者缺乏特异的核酸内切酶，紫外光照射后易患皮肤癌§19.5DNARecombination遗传重组主要类型：(依据对DNA序列和所需蛋白质因子的要求)同源重组(HomologousRecombinationorGeneralRecombination)位点专一性重组(Site-specificRecombination)其共同点是双股DNA间的物质交换，但发生的情况不同。一、同源重组/普遍性重组1.同源重组：依赖大范围的DNA同源序列的联会，重组过程中，两个染色体或DNA分子交换对等的部分。例：同源染色体非姐妹单体交换；细菌的转化、转导、结合；噬菌体的重组…需要重组的蛋白质参与；（例如.大肠杆菌：RecA蛋白、RecBC蛋白）蛋白质因子对DNA碱基序列的特异性要求不高；（存在重组热点和序列长度的影响）真核生物染色质的状态影响重组的频率。2.条件：2个DNA分子序列同源，且同源区域越长越有利。3.功能：维持种群的遗传多样性；有助于DNA的损伤修复；使真核生物产生第一次减数分裂中染色体正确分离到子细胞至关重要的瞬间物理连接。同源重组的分子机制、Holliday模型二、位点专一性重组原核生物中最为典型特点：供体与受体的特定位点的短同源序列之间。DNA精确切割、连接DNA不失去、不合成、不交换对等部分（有时是一个DNA分子整合到另一个DNA分子中，又称整合式重组），需要位点专一性的蛋白质因子参与。通过attP和attB间的相互重组，环状的噬菌体DNA转换为整合的原噬菌体，原噬菌体通过attL和attR间的相互重组而切除三、异常重组—生物转座子转座子(transposon,Tn):基因组内不必借助于同源序列就能改变自身位置的一端DNA序列.异常:转座、重组发生在非同源序列间，不需RecA蛋白（一）原核生物中的转座子1.插入序列（insertedsequence,IS)：长度在768-5700bp,两端具几~几十bp的反向重复序列2.转座子：使宿主菌获得一定特性大(2000-25000bp)，转座有关的基因,抗药性及其他基因，两端具相同或同源序列。如IR序列。3.转座噬菌体：Mu噬菌体与其他温和性噬菌体的差别：其基因组不论在进入裂解周期或处于溶源状态都可随机整合到宿主染色体的任何位置，且游离的和已整合的基因次序是相同的.（二）真核生物中的转座子酵母菌的转座子：Ty系列，长度约6300bp，两端含有两个δ正向重复序列，其插入酵母菌染色体后，受体出现5bp的正向重复序列。果蝇的转座子：P因子：杂种不育ORF0ORF1ORF2ORF3，内含子1，2，3P（母）xP（父），M（母）xM（父），P（母）xM（父）：F1正常；P（父）xM（母）：F1不正常玉米的转座子1932年，美国玉米遗传学家B.McClintock发现玉米籽粒色斑不稳定遗传现象，于1951年，第一次提出转座因子的概念。糊粉层颜色：ACRPrI/Ds花色素颜色红紫抑制因子解离因子I/Ds：解离因子Ac：激活因子DNAtransposableelement本章要点1、掌握生物学中心法则。2、掌握DNA聚合酶催化的反应，复制保真性依赖的机理。3、掌握DNA点突变、缺失、插入、倒位的概念、损伤的修复方式。4、掌握半保留复制，不连续复制的概念。5、熟悉解链酶，拓扑异构酶，引物酶及DNA连接酶催化的反应。3DNA复制时，如模板链为5′-TAGA-3′将会合成哪种互补结构？A5′-TCTA-3′B5′-ATCT-3′C5′-UCUA-3′D5′-AUCU-3′4名词解释半保留复制前导链滞后链岗崎片段点突变5在DNA半保留复制中，两条新合成的链为什么都可以沿5′→3′方向延长？