Gateway-载体构建

Gateway技术克隆、表达新方法Gateway技术Gateway技术：一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（EntryVector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（DestinationVector，目的载体）上。Gateway技术特点：通过去除冗长的亚克隆步骤节省操作时间，同时将目的基因转移到多个表达系统，在任何选择的表达系统如细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物进行基因的分析表达。Gateway技术的灵活性：Gateway技术的原理Gateway的原理也是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。在噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和attP位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来。这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。整合后的附着位点为attL（BOP’）attR（POB’）整合位点---attBattP切除位点---attLattR整合过程需要Int和IHF共同作用attBxattP→attLxattR完成构建Gateway表达克隆仅需两步（1）创建入门克隆,通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。（2）混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体以及GatewayLRClonase酶，构建表达克隆BP和LR反应示意图BP反应LR反应反应特点:入门载体的构建（1）限制性内切酶消化和连接进入入门载体（2）PCR克隆（定向TOPO克隆至入门载体或与供载体B×P重组）PCR定向TOPO克隆PCR定向TOPO克隆流程一：实验前的准备1：认真阅读INVITROGEN公司的GATEWAY-MANUAL2;在实验操作前，先要确保你的基因使用高保真的Taq酶克隆经过验证，装入T载体中3:入门载体质粒和目标表达载体质粒的抽提。质粒的浓度要求比较高，150ng/ul.4:引物设计。根据入门载体序列的特点，设计通用引物和含部分接头的基因特异性引物引物设计：1通用引物：attB1adapter:5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’attB2adapter:5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’2含部分接头的基因特异性引物：attB1+geneforward:5’-AAAAAGCAGGCTNN-template-specificsequences-3’attB2+genereverse:5’-AGAAAGCTGGGTN-template-specificsequences-3’BP重组装入入门载体1:添加attB接头的PCR以携带目的基因质粒为模板，加含部分接头的基因特异性引物,进行第一轮PCR2:取第一轮的PCR产物做模板，加入通用引物，进行第二轮3：PCR产物的纯化4：BP重组反应BP重组反应ComponentsSampleattB-PCRproduct（10ng）1-7ulpENTRvector(150ng/ul)1ul5XBPClonaseClonaseenzymemix2ulTEBuffer,pH8.0to10ul25℃温浴1-16h。随着时间的延长，可有效增加克隆，但时间不宜超过18h,终止反应后，最后取1-5ulBP反应液转化大肠杆菌。挑取阳性克隆，进行PCR或验证，然后抽提质粒，酶切验证。LR重组装入表达载体根据自己实验目的，了解自己将要装入的载体的结构，原核表达，超表达，抑制表达、特异表达、GUS/GFP表达等载体，LR重组反应ComponentsSampleEntryclone（50-150ng）1-7ulDestinationvector(150ng/ul)1ul5XLRClonaseenzymemix2ulTEBuffer,pH8.0to10ul25℃温浴1-16h。终止反应后，最后取1-5ulBP反应液转化大肠杆菌挑取阳性克隆，进行PCR或验证，然后抽提质粒，酶切验证。Gateway技术的评价一旦构建好Gateway入门克隆，蛋白表达和分析的大门就会向您敞开。使用Gateway技术，您可以进入到几乎是无数种的表达系统。因为没有一个单一的表达系统适合于每一种蛋白，优化基因表达的最好方法是在多个系统中分析您的蛋白Invitrogen已将Gateway技术合并到部分最高级的表达系统中。无论选择哪个系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――都可以获得Gateway目的载体。此外，你可以很容易地把最称手的表达载体转换成Gateway目的载体Gateway表达载体的转换连接多个片段到表达载体